p53在氟苯尼考诱导三疣梭子蟹线粒体介导的细胞凋亡中的作用研究

Florfenicol (FLR) is widely used in the prevention and treatment of bacterial diseases of aquatic animals, which can induce immune toxicity, leading to serious negative on the healthy development of aquaculture. p53 is a transcription factor, which plays an important regulatory role in apoptosis. In our previous study, we confirmed that FLR can induce apoptosis of Portunus trituberculatus, while the molecular mechanism of p53 is not clear. In the present study, P. trituberculatus will be treated with FLR. Sub microstructure change of cells will be assessed by virtue of transmission electron microscopic observations to pinpoint its effect in FLR induced apoptosis. The molecular mechanism of p53 mediated apoptosis by FLR will be investigated by qPCR, Western-blot and RNAi techniques. The effect of miR-125-3p on the inhibition of the expression of p53 will be verified by double fluorescence report technique and overexpression of miRNA experiment. The BSP technique will also be used to analyze the methylation of p53 gene. Our results will be demonstrated the influences and the involved mechanism in FLR-induced cytotoxicity, which can be useful for guiding the rational use of FLR in aquaculture.

氟苯尼考（Florfenicol, FLR）被广泛用于水产动物细菌病的预防和治疗，大量使用会引起免疫毒性，严重影响水产养殖业的健康发展。p53是细胞凋亡中发挥重要调控作用的一种转录因子。本项目组前期证实FLR能够诱导三疣梭子蟹发生细胞凋亡，但p53在此过程中的分子调控机制尚不明确。本项目拟对三疣梭子蟹进行FLR胁迫，通过透射电镜观察，查明FLR诱导细胞凋亡效应；通过qPCR、western-blot及RNAi技术，阐释p53介导的FLR诱导三疣梭子蟹细胞凋亡发生的分子机制；采用双荧光报告和miRNA过表达技术，验证miR-125-3p在p53基因表达抑制中的作用；通过BSP技术分析p53基因在FLR胁迫后的甲基化特征。最终阐明FLR胁迫下三疣梭子蟹p53基因在线粒体介导细胞凋亡中的分子调控机制。研究结果可以明确FLR对三疣梭子蟹线粒体的毒性机制，同时有助于指导FLR在水产养殖中的合理使用。

三疣梭子蟹是我国海水养殖的主导品种之一，具重要的经济价值。然而，近年来随着集中养殖的不断发展，梭子蟹病害的发生也越来越频繁，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。氟苯尼考（Florfenicol, FLR）被广泛应用于三疣梭子蟹细菌性疾病的预防及治疗。然而，氟苯尼考的大量使用会引起免疫毒性，严重影响水产养殖业的健康发展。p53是细胞凋亡中发挥重要调控作用的转录因子。本人的前期研究结果已证实FLR能够诱导三疣梭子蟹发生细胞凋亡，但p53在此过程中如何发挥调控作用的分子机制尚不明确。本项目解析了转录过程中和转录完成后p53在线粒体介导细胞凋亡中的分子调控机制，取得的主要进展如下：1）随着FLR胁迫时间的增长，肝胰腺组织损伤程度逐渐加剧，包括基底膜、管腔及上皮细胞的形态和结构的改变，推测高剂量FLR会对三疣梭子蟹重要解毒代谢器官(肝胰腺)产生一定的毒副作用。2）克隆得到Ptp53、PtBcl-2、PtBax相关凋亡基因的cDNA全长，同时采用实时荧光定量PCR、RNAi、western blot和酵母双杂交技术研究这些基因在FLR胁迫后的功能，结果表明p53通过调控Bcl-2、Bax 等因子调控线粒体膜蛋白cyt-C释放，在Apaf-1参与下，激活caspase-3执行细胞凋亡。3）miRNA的表达谱数据结果显示，共检测到144个miRNA，其中25个已知的mRNA，119个新预测的mRNA；差异miRNA分析结果显示，DMSO对照组与3h的FLR高剂量组、DMSO对照组与12h的FLR高剂量组之间差异表达的miRNAs分别是35个和31个，并进行了qPCR验证；GO和KEGG功能富集分析，预测的靶基因参与免疫相关通路(如胞吞作用、JAK-STAT信号通路、凋亡通路)和外源物质代谢相关通路(如细胞色素P450代谢、ABC转运蛋白)；双荧光报告证明miRNA可通过调控细胞凋亡、解毒代谢相关基因的表达，从而参与三疣梭子蟹体内的FLR代谢过程。4）FLR胁迫后，FLR诱导p53基因的表达，具有明显的时间-剂量效应；三疣梭子蟹肝胰腺p53基因目的片段甲基化水平显著降低，由此推测在FLR胁迫后p53基因甲基化水平和表达量成负相关。研究结果明确了FLR对三疣梭子蟹线粒体的毒性机制，可以用于三疣梭子蟹的健康生理评估，同时有助于指导FLR在水产养殖中的合理使用。