心肌成纤维细胞干细胞特性及心肌分化的分子机制研究

Accounting for 60% of the total amount of heart cells, the cardiac fibroblasts (CFs) have a higher proliferation and metabolic activity. Our previous research showed that: CFs expressed embryonic genes of Oct3, Sox2, c-Myc and Nanog, and myocardial stem cell markers Sca-1, c-kit, and mesenchymal stem cell marker CD73; CFs can be induced in vitro to osteogenic, adipogenic and myocardial differentiation; and CD73 significantly influence the myocardial differentiation efficiency. But it is not clear whether these factors are key factors of CFs myocardial differentiation? If this relationship could be clearly understood, an important theoretical foundation would be provided for the regulation of CFs myocardial differentiation. This study intends to: ①detect the expression regularity of Oct3, Sox2, c-Myc and Nanog in CFs and analyse their roles in CFs myocardial differentiation. ②compare the positive CFs myocardial differentiation efficiency of Sca-1 and c-kit, and be clear about the superior subsets.③explore the regulation of CD73 on myocardial differentiation of superior subsets, and reveal the relationship between CD73 and Sox2, c-Myc, Oct3, Nanog.④overexpressed and interfered CD73 subset were implantated to heart of the myocardial infarction model in vivo and verified the potential of stem cells and also the mechanism of the CFs myocardial differentiation so as to provide new ideas for clinical treatment of myocardial injury.

心肌成纤维细胞（CFs）占心脏细胞总量60%，有较高的增殖和代谢活性，前期工作显示：CFs表达胚胎基因Oct3、Sox2 、c-Myc和Nanog和心肌干细胞标记sca-1、c-kit及间充质干细胞标记CD73；体外诱导CFs可向成骨、成脂和成心肌分化；且CD73明显影响心肌分化效率。但尚不清楚这些因子是否为CFs心肌分化关键因素?如明了其之间相互关系，将对调控CFs心肌分化提供重要理论依据。本研究拟①检测CFs中Oct3、Sox2、c-Myc和Nanog表达时程规律，分析其在CFs心肌分化中作用。②比较sca-1、c-kit阳性CFs心肌分化效率，明确优势亚群；③探讨CD73对优势亚群心肌分化的调控，揭示CD73与Sox2、c-Myc、Oct3、Nanog间关系。④心肌梗死模型植入过表达、干扰CD73的CFs优势群，在体证实CFs心肌分化的干细胞潜能和机制，为临床治疗心肌损伤提供新思路。

本研究发现心肌成纤维细胞（CFs）具有干细胞样的生物学特性，在体外具有成骨、成脂、成心肌多向分化潜能，可能是体内巨大的分化再生的细胞库，这一结果对传统理论提出了新的思路。证明了流式细胞仪分选出来的CD90+ CFs是心肌样细胞分化的优势亚群，通过细胞移植可对心肌损伤起一定的治疗作用，这类细胞可作为种子细胞用于心肌损伤修复的基础和临床研究。Tbx5在心肌化过程中能激活心肌转录相关基因cTnT、α-actin、Mef2c和抑制多能性基因Nanog、Oct4、Sox2的表达。Tbx5过表达更有效地上调了CFs中cTnT的表达。相反，Tbx5的下调降低了cTnT和wnt3a的表达。此外，GSK3抑制剂Chir99021预处理后，Tbx5i对体外心脏重编程的抑制作用被逆转。这一发现为心脏再编程的机制提供了新的见解，并为今后的临床应用奠定了基础。另外发现一些心肌特异性蛋白CENP-A、HCN4、Elastin在心脏不同部位和不同时段表达规律及动态变化，首次发现成纤维细胞表达HCN4，其对心肌细胞和成纤维细胞增殖功能仍需进一步研究。心外膜和血管平滑肌处的CENP-A持续表达提示该处在心肌细胞从新生到老年期均保持增殖更新能力。在探讨CFs功能的同时，首次发现心肌细胞表达Elastin，可能对心肌收缩和舒张的势能和心梗后的心室重塑会有一定作用。研究了急性心肌梗死后心脏胶原蛋白和弹性纤维的动态变化及其与心功能的关系，解释了心肌损伤后心肌组织弹性下降、硬度增加结构原理是由于胶原和弹性纤维比例失调所致。对心肌分化前后表达差异显著的基因进行GO富集分析，初步发现有Tpm1，Tpm2，Pdlim3和Wnt2b四个基因在心肌分化中起重要作用，其中Tpm1是调控心肌分化的关键基因。结合临床样本研究了ADAMTS7 基因不同位点单核苷酸多态性（SNP）与冠心病的联系，但是否通过调控心肌细胞凋亡对心功能产生影响有待进一步研究，本研究将有助于动脉粥样硬化患者从ADAMTS7的SNPs个性化诊疗中受益。