心脏特异性靶向载体微泡的构建及其在心脏疾病中的应用价值

Ultrasound microbubbles can be used as a vector for cells, drugs and genes. But the quantity of these kinds of substances they can carry is limited. On the other hand, they are lack of organ or tissue selectivity as well. We make the hypothesis that construction of a kind of lipid microbubbles which can carry a lot of macromolecular substances and can accumulate in coronary capillary bed will increase the efficiency of treatment in heart diseases. We will construct the lipid microbubbles containing the C3F8 gas by a sonicator and we will modified the microbubbles with polyethylene imine -β- cyclodextrin (PEI -β-CD) nanoparticles. The nanoparticles can form tight complex with macromolecular materials because its basket-like shape. They can hold large amount of substances and can protect them from degeneration by lysosomal and enzymes. By this means, the microbubbles will be a vector which can load large amount of therapeutic substances. At the same time, we will conjugate biotinylated intercellular adhesion molecule (ICAM-1) monoclonal antibody to the surface of biotinylated microbubbles via a biotin - avidin linking. Thus the microbubbles will selectively adhere to the surface of pathological endothelial cells in coronary artery disease. Because the endothelial cells express this surface protein in coronary atherosclerosis. To test the function of the target vector microbubbles, we make the reporter gene LacZ be the aim gene because gene transfection has high specificity and expression is easy to detect. We will make the target vector microbubbles load this gene and inject them via systemic injection in the heart ischemia-reperfusion model in mice. Then we will destruct the microbubbles on the precordium and detect the transfection efficiency for LacZ gene. We think it will be possible to provide an efficient target vector for cells, drugs or genes in the treatment of heart disease.

超声微泡能作为细胞、药物、基因的载体，但是携带的量有限，且缺乏器官或组织的选择性。我们设想通过将含C3F8气体的脂质微泡以聚乙烯亚胺-环糊精（PEI-β-CD）纳米粒修饰，利用该纳米粒能包合大量大分子物质的特性提高微泡的载量；同时将抗ICAM-1单抗以生物素-亲和素桥接于微泡表面，赋予微泡靶向性，以期构建一种针对病理性心脏的炎症内皮靶向性的载体微泡，使之经静脉注射后能在病变的冠脉血管床粘附，浓聚，从而提高治疗物质的疗效。为了验证该靶向性载体微泡的功效，利用基因转染结果高度特异和表达易于检测的特点，以报告基因LacZ为实验基因，将靶向性载体微泡携带该基因，以心肌缺血模型小鼠为实验对象，观察超声破裂PEI-β-CD-LacZ-ICAM微泡在心肌缺血小鼠心脏的转染效率，有可能为临床提供一种定向在心脏释放细胞、药物或基因的高效载体。

超声微泡临床上作为一种造影剂已经广泛使用，它通过静脉注射能顺利地通过肺循环到达左心室，进而分布全身各个脏器，在临床工作中帮助诊断已有多年，其安全性是可靠的。但作为物质载体的功能是进年来研究的新成果。目前应用的超声微泡是非靶向性的，即它经过静脉注射后，随血流灌注全身，在某个脏器的停留时间和灌注量完全取决于该部位固有的血流动力学特征，没有器官特异性。另一个存在的问题是，携带物质的量有限。其结合力依靠正负电荷相吸的原理，结合的量有限，结合力不牢固。. 基于目前存在的问题，我们设想构建一种心脏特异性靶向微泡，既能搭载很多大分子物质，又能靶向性结合至心脏，将可能为今后心脏疾病的治疗提供高效的载体。我们设计以环糊精（CD）纳米粒对超声微泡进行相应的修饰，借助CD对基因的保护作用，将CD与微泡进行耦合，使单个微泡携带更多的基因；同时因为在心肌缺血时，冠脉内皮细胞大量表达细胞黏附分子（ICAM-1），所以，将微泡以抗ICAM-1抗体进行修饰，使微泡在心脏浓聚，从而达到使基因在心脏浓聚的效果，有可能高效地将治疗性物质定向导入心脏。. 经过一年的实验，我们成功构建了载体微泡，该微泡由CD和二茂铁(Fc)耦联，借助DSPE将CD嵌入脂质体微泡（声诺维微泡）壁，由CD携带PEI浓聚的DNA，达到将大量DNA牢固耦联与微泡壁的目的。我们对该载体微泡的功能也进行了验证。在超声照射下，于培养的细胞中取得较高的转染效率。优化后的超声转染条件是2.5W/cm2，200 μL微泡/孔的微泡浓度，60 s的照射时间，取得的转染效率最高，较PEI/DNA组提高20倍，较裸质粒与声诺维组高几乎104倍。细胞的活性实验证明该耦联微泡对细胞活性影响不大。. 但靶向微泡的构建遇到困难。生物素化耦联微泡与亲和素包被板的反应失败。原因可能是因为耦联微泡在DSPE-PEG(2000)的基础上，连接了二茂铁和CD，其分子长度长于生物素的支链，妨碍了生物素与亲和素结合位点的反应。所以下一步需要改进实验条件，延长生物素支链以保证生物素亲和素的反应，以便达到靶向结合细胞的目的。