食管鳞癌中Nrf2调控CaMKIIα的机制研究

The imbalance between reactive oxygen species (ROS) generation and elimination can induce the autophagy of malignant cell. However, the underlying molecular mechanisms are sophisticated and poorly understood.Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) is an antioxidant-activated transcription factor that recently emerged as a critical regulator of cellular defense against oxidative and contributes significantly to the pathogenesis of various cancers. In our previous study, we found that triterpeniod CDDO-Me could activate Nrf2 in esophageal squamous carcinoma cells (ESCC). The up-regulated Nrf2 supressed ROS and induced autophagy through the activation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II alpha (CaMKIIα).In this study, we attempt to explore the regulation mechanism of CaMKIIα by Nrf2 in ESCC. The hypothesis will be tested in both in vitro and in vivo studies. We will investigate the impact of Nrf2 expression levels on ROS-mediated activation of CaMKIIα firstly. And then, the study will find that Nrf2 can bind to the regulation domain of CaMKIIα and active its transcription directly. And the impact of nrf2 regulated CaMKIIα on autophagy in ESCC will be explored later. This study will disclose a potential mechanism of oxidation/antioxidation imbalance induced autophagy and that will aid the development of new strategies and novel anti-cancer drug targets for ESCC.

氧化应激/抗氧化应激失平衡诱导恶性肿瘤细胞发生自噬的机制复杂。我们前期研究发现：三萜类药物CDDO-Me可以上调食管鳞癌细胞Nrf2表达，降低活性氧（ROS）水平，诱导食管鳞癌细胞发生自噬；同时发现上调Nrf2诱导的自噬与CaMKIIα有关。本研究拟进一步探讨，Nrf2对CaMKIIα调控的具体机制。本研究通过体内、外实验，观察上调或干扰Nrf2表达，对ROS、磷酸化CaMKIIα、氧化CaMKIIα、总CaMKIIα表达的影响，证实Nrf2介导抗氧化应激，激活CaMKIIα，诱导食管鳞癌自噬；并证明，Nrf2直接与CaMKIIα基因调节域位点结合，激活CaMKIIα，启动自噬。从而揭示Nrf2调控CaMKIIα信号分子的机制，以及对食管鳞癌自噬的影响。本研究将为深入探讨氧化应激/抗氧化应激失平衡诱发肿瘤细胞自噬的具体分子机制，以及发现食管鳞癌新的治疗靶点，开发靶向治疗药物奠定实验基础。

食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，其预后较差主要与早期病变诊断率低和缺乏有效的治疗药物有关。深入研究氧化应激/抗氧化应激失平衡诱发食管鳞癌细胞自噬的调控机制及其在介导放射抵抗中的角色，是发现新的治疗靶点，改善食管鳞癌患者预后的重要途径之一。我们的前期研究发现：三萜类药物CDDO-Me可以上调食管鳞癌细胞Nrf2表达，降低活性氧簇（ROS）水平，诱导食管鳞癌细胞发生自噬。同时研究还发现，CaMKIIα参与了Nrf2诱导的自噬。作为重要抗氧化应激效应分子和介导肿瘤放射抵抗分子，Nrf2如何影响CaMKIIα和自噬的激活，进而参与食管鳞癌放射抵抗的调控尚缺乏足够多的证据。本研究首先采用慢病毒转染技术，上调Ec109和KYSE30食管鳞癌细胞的Nrf2表达水平。接着，利用RT-PCR、Western-blotting、流式细胞仪等技术证实过表达Nrf2可以上调食管鳞癌Ec109和KYSE30细胞磷酸化CaMKIIα、CaMKIIα表达水平和自噬活性。随后的CCK8细胞增殖活性检测实验和克隆形成实验证实，Nrf2过表达可以介导食管鳞癌细胞放射抵抗。机制研究发现，Nrf2通过与CaMKIIα启动子区域结合，促进CaMKIIα转录、上调磷酸化CaMKIIα表达水平，诱导食管鳞癌细胞自噬，进而介导放射抵抗。最后，通过裸鼠成瘤实验和食管鳞癌患者组织病理学标本，在体内证实Nrf2调控CaMKIIα，介导放射抵抗的分子机制。本研究通过揭示食管鳞癌中Nrf2调控CaMKIIα的机制，为深入探讨氧化应激/抗氧化应激失平衡诱发肿瘤细胞自噬的分子生物学机制及其在介导放射抵抗中的作用，为发现食管鳞癌新的治疗靶点、开发新的治疗药物奠定了实验基础。