基于肠道微生态调控的板蓝根蛋白抗流感病毒化学结构与免疫调节机制研究

Virus infection can affect the host intestinal microflora, and then further influence the host immune function. Our previous studies and literature reports confirmed that proteins of Radix Isatidis could fight against influenza virus through immunoregulation, and certain effect on the intestinal bacteria. Based on these findings, we put forward a scientific hypothesis- “Radix Isatidis proteins could affect the body's immune function to fight against influenza virus via regulating microecology of host intestinal”. The detailed investigations is thus designed as follows: (1) application of nuclear magnetic resonance, scanning atomic force, N-terminal sequencing methods to identify structural characteristics of Radix Isatidis proteins; (2) adopting high-throughput sequencing, enzyme-linked immunoassay, gene chip technologies to evaluate the effect of Radix Isatidis proteins on intestinal flora diversity, immunocytokine secretion and immune gene expression; (3) utilization of proteomics and surface plasmon resonance technology to reveal targets of Radix Isatidis proteins against influenza virus; (4) exploration of potential relationships between immunity against influenza virus and intestinal bacteria by correlation analysis of intestinal bacteria and immunity indexes. The project aims to reveal the structural characteristics of Radix Isatidis proteins and systematically elucidate their mechanisms of anti-influenza virus action via intestinal flora-mediated immunoregulation, which might provide more scientific proofs for reasonable development and utilization of Radix Isatidis protein resources.

病毒感染可影响宿主肠道微生物群落，进而影响宿主机体免疫功能。本课题组前期研究和文献报道已证实板蓝根蛋白抗流感病毒作用确切且具有调节机体免疫功能和影响肠道菌群的作用。据此提出“板蓝根蛋白可通过调控宿主肠道微生态进而影响机体免疫功能发挥抗流感病毒作用”的科学假说，拟开展以下研究工作：（1）采用核磁共振、原子力扫描、N端测序等方法表征板蓝根蛋白结构特征；（2）运用高通量测序、酶联免疫分析、基因芯片等技术，评价板蓝根蛋白对肠道菌群多样性、免疫细胞因子分泌、免疫基因表达的影响；（3）利用蛋白质组学和表面等离子体共振技术揭示板蓝根蛋白抗流感病毒的作用靶点；（4）基于差异菌群与免疫指标的相关性分析，挖掘肠道菌群与板蓝根蛋白抗流感病毒免疫调节作用之间的潜在关系。旨在揭示板蓝根蛋白结构特征，系统阐明板蓝根蛋白调控肠道微生态抗流感病毒的免疫调节机制，为板蓝根蛋白资源的合理开发与利用提供科学依据。

板蓝根蛋白抗流感病毒作用确切且具有调节机体免疫功能的作用，但其结构及抗病毒作用机理尚未阐明。因此本项目旨在通过现代生物学、微生物学及蛋白质组学等前沿技术对板蓝根蛋白结构及其作用机制进行研究。. 本项目首先建立板蓝根蛋白质检测的方法，研究板蓝根蛋白的功能特性和稳定性，较为全面的掌握板蓝根蛋白的组成及功能性质相关的信息。然后以抗病毒活性为导向分离获得目标蛋白，运用LC-MS/MS技术对蛋白进行鉴定，确定其氨基酸序列，采用同源建模的方法构建TPI1蛋白三级结构模型。基于定量蛋白质组学TMT技术揭示板蓝根蛋白抗流感病毒的作用机制，对质谱鉴定到的差异表达蛋白进行生物信息学分析，明确板蓝根活性蛋白发挥抗病毒作用的潜在作用靶点及信号通路。研究结果表明板蓝根蛋白在病毒感染初期起到较好的预防作用，通过激活宿主细胞补体系统、溶酶体等免疫相关信号通路发挥抗病毒作用。应用Illumina高通量测序技术评价板蓝根蛋白对免疫抑制小鼠肠道菌群多样性、关键菌群数量及菌群结构的影响；采用Metastats、LEfSe、PCA等多元统计学方法对不同组别的小鼠肠道菌群结构进行比较分析；采用酶联免疫吸附测定法测定小鼠小肠及血清免疫细胞因子。研究表明板蓝根蛋白可以显著提高小鼠小肠和血清免疫细胞因子水平。为进一步挖掘肠道菌群与板蓝根蛋白免疫调节作用之间的潜在关系，进行差异菌群与免疫指标的相关性分析。研究发现颤杆菌克属、罗斯氏菌属、Marvinbryantia菌属等与板蓝根蛋白发挥免疫调节作用具有显著的相关性。本项目首次构建了板蓝根活性蛋白的三级结构模型，以肠道菌群为切入点，结合定量蛋白质组学技术，并进行关联性分析，揭示了板蓝根蛋白通过免疫调节发挥抗病毒作用的潜在作用机制及密切相关的菌属。. 项目实施期间本人荣获江苏省中医药科学技术奖二等奖1项（排名第四）、中华中医药学会科学技术奖三等奖1项（排名第四）；发表SCI论文2篇，会议论文3篇，待发表论文3篇；获得授权专利2项，申请专利3项，实施专利转化2项。