TLRs在PCV2引起仔猪免疫抑制中的作用研究

由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪圆环病毒病（PCVD）是猪最重要的疾病之一，严重危害世界养猪业。PCV2对固有免疫的抑制是其致病的关键。Toll样受体（TLRs）通过识别病原相关分子模式（PAMP）启动细胞信号途径，不仅是固有免疫的基础，也是固有免疫和适应性免疫的桥梁。本项目拟进行以下研究：（1）用PCV2作用于其主要影响细胞-猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和淋巴细胞,观察TLRs及其信号途径和效应启动的变化；（2）用siRNA技术构建TLRs启动信号途径中的关键分子MyD88基因沉默PAMs,再用PCV2攻击，比较2种PAMs对PCV2的反应、TLRs表达及其效应启动的差异；（3）用PCV2感染仔猪，动态观察PAMs和免疫器官中TLRs及其信号途径的时空变化。从细胞和整体水平解读TLRs在PCV2引起仔猪免疫抑制中的作用，进一步揭示PCV2的致病机制，为防治PCVD奠定理论基础。

猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）正严重危害世界养猪业，其主要病原-猪圆环病毒2型（PCV2）引起仔猪免疫抑制是PCVAD发生的关键。探讨Toll样受体（TLRs）及其信号途径在PCV2引起仔猪免疫抑制中的作用，可为防治PCVAD提供新的策略。本研究揭示了：（1）PCV2感染后，可明显上调PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10；改变TLR2、TLR3、TLR4、LR7、TLR8和TLR9的表达；同时明显诱导PAMs中MyD88和p-IκB蛋白表达，促进PAMs中NF-κB/P65蛋白入核并与DNA结合；而一旦用小干扰RNA（siRNA）方法使PAMs中MyD88基因沉默，PCV2活化MyD88-NF-κB信号途径的作用和促进细胞因子分泌的作用也即消失。表明PCV2可以通过TLRs-MyD88-NF-κB信号途径调控体外培养猪肺泡巨噬细胞（PAMs）分泌细胞因子。（2）PCV2感染后，可明显下调体外培养仔猪淋巴细胞IL-4和上调IL-12的分泌；显著改变TLR2、TLR3、TLR4和TLR9的表达；明显促进淋巴细胞中NF-κB入核并与DNA结合；明显促进淋巴细胞胞浆内p-IκB和MyD88蛋白的表达。当用NF-κB抑制剂（BAY 11-7082）抑制了NF-κB的表达，PCV2活化MyD88-NF-κB信号途径的作用和调节细胞因子分泌的作用也即消失。说明PCV2可以通过激活TLRs-MyD88-NF-κB信号途径调节体外培养仔猪淋巴细胞IL-4和IL-12的分泌。（3）PCV2作用PAMs后可显著上调IFN-α和IFN-β基因转录和蛋白表达水平，但与NF-κB信号途径无关；而与MyD88、 IRF-3和IRF-7 表达呈明显正相关。表明PCV2可以通过MyD88-IRFs信号途径上调PAMs中I型干扰素的表达。（4）运用质谱分析结合绝对定量的等量异位标签技术（TMT），对PCV2作用PAMs细胞6h后的磷酸化蛋白进行分析，共发现了213个差异表达磷酸化蛋白，这些蛋白涉及生物结合、细胞骨架、信号转到与细胞黏附等。了解这些差异表达蛋白，为进一步研究PCV2的致病机理奠定了基础。