滑菇多糖作用于树突细胞的受体识别及其在NF-кB信号通路中的作用

本课题以小鼠髓源树突状细胞为研究对象,从细胞免疫表型,抗原提呈功能以及相关细胞因子的表达等方面观察滑菇多糖对树突状细胞功能的影响；以流式细胞仪和大分子互作仪为手段，采用特定受体突变体法和竞争性抑制法，识别滑菇多糖作用于树突状细胞上的可能受体（包括TLR4/2、CD14、MR和Dectin-1）；采用应用实时定量PCR技术和RNA干扰技术观察滑菇多糖是否经TLR4/2介导抑制树突状细胞的NF-кB信号通路来发挥其免疫调节作用，明确其它受体（CD14、MR和Dectin-1）是否也协助参与其作用。本课题从细胞信号通路和分子水平探求滑菇多糖对树突状细胞的抑制作用及其可能免疫调节机制。本课题为滑菇的开发利用提供科学依据和技术基础。

本课题从滑菇多糖对小鼠髓源树突细胞（BMDCs）成熟的作用、滑菇多糖作用于BMDCs时受体的识别、以及滑菇多糖对BMDCs内NF-кB信号通路的作用三个方面，研究了滑菇多糖的免疫活性功能及可能作用机制。结果表明：.（1）倒置荧光显微镜和透射电镜下三种滑菇多糖（PNPS-1，PNPS-2和PNPS-3）作用于BMDCs后未观察到成熟时的特有形态学特征；流式细胞法检测三种滑菇多糖能够下调六种表型分子的表达率；混合淋巴细胞反应结果表明三种滑菇多糖刺激的BMDCs后不仅不能刺激淋巴细胞的增殖，而且能显著抑制LPS刺激淋巴细胞的增殖作用；Northern blot和ELISA实验结果表明三种滑菇多糖都能够降低IL-12和TNF-a的表达，提高IL-10的表达；可推断三种滑菇多糖能够抑制BMDCs的成熟。.（2）通过Octet大分子互作系统对三种滑菇多糖和五种受体蛋白（TLR2、TLR4、Dectin-1、CD14和MR）的相互作用亲和力进行测定和分析。实验结果表明三种滑菇多糖都能够亲和结合受体TLR2和Dectin-1，只有PNPS-3能够亲和结合受体MR。实验结果证实了滑菇多糖能与BMDCs上的受体亲和结合。.（3）通过RT-PCR法检测滑菇多糖作用BMDCs后23个NF-кB信号通路相关基因mRNA的变化并综合分析，结果表明滑菇多糖对NF-кB信号通路起下调作用；受体Dectin-1和MR协同参与了对NF-кB信号通路的作用。通过对BMDCs采用抗体封闭TLR2/4和腺病毒转染受体沉默TLR2/4的方法建立对照，然后加入滑菇多糖刺激BMDCs，RT-PCR法检测5个NF-кB信号通路主要相关基因mRNA的表达，Western blot法检测NF-кB信号通路主要蛋白IKKβ和p65表达，流式细胞仪检测ICAM-1的表达，确认TLR2是滑菇多糖作用于BMDCs的受体，而不是TLR4；通过ELISA法和免疫细胞化学方法检测NF-кB P65的活性和核表达，证实滑菇多糖是通过调节TLR2-NF-кB通路的活化水平来发挥其免疫调节作用。.本课题实验采用的受体与功能分子之间识别方法具有直观，高通量，经济，可靠，重现性好的特点。本课题的研究结果对揭示滑菇多糖的免疫学功能作用机理提供重要的理论基础。