利用猪全基因组sgRNA文库筛查异种排斥靶标基因

Although xenotransplantation using genetically modified pigs as the transplant source has the potential to resolve the severe clinical shortage of human organ donors, the genetic modification strategies have been reported cannot overcome xenorejection completely, the residual xenogeneic engraftment rejection maybe elicited by xenoantigens in pig cell surface which have not been disclosed at present. As lack of an appropriate tools, xenoantigens in pig genome has not been fully illustrated. Recently, Cas9-based functional gentic screening tools providing a high-throughput and efficient approach to discover new potential xenoantigens in pig genome. Pig vascular is the first protective shelter between xenograft and host, the xenoantigen of vascular endothelial cell is attacked by the nature antibody firstly, which makes vascular endothelial cell an ideal model for xenoantigen study. So, we constructed the porcine Cas9-gRNA library and endothelium cell line that expressed Cas9 protein stably for the first time. This project will use a pooled in vitro and in vivo genetic screening approach using CRISPR-Cas9 genome editing in pig vascular endothelial cell line treated with human serum complement system and non-human primate innate immune system to discover previously undescribed xenoantigen genes, providing new theories to construct genetically modified pig for the future of clinical application.

虽然异种移植基因修饰猪有望解决临床供体器官短缺问题，但是目前已报道的基因修饰策略并不能完全消除异种排斥障碍，仍存在免疫排斥可能由猪细胞表面尚未发现的异种抗原引起。由于缺乏合适的研究手段，猪基因组中异种抗原基因还未被完全发现。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的全基因组筛选具有高通量和高效率的特点，为系统性研究异种抗原基因提供了有力的工具。猪血管是移植器官与受体免疫系统之间第一道屏障，其表面分布的异种抗原是天然抗体攻击的主要靶点，因此猪血管内皮细胞是用来研究异种抗原基因理想的细胞模型。为此，我们构建了首个猪全基因组Cas9-gRNA文库和稳定表达Cas9猪血管内皮细胞系。本项目拟通过人血清补体系统和灵长类内源免疫系统对猪细胞的异种排斥作为筛选压力，寻找猪基因组中尚未发现的异种抗原基因，为异种移植基因修饰猪研究提供全新的理论基础。

随着我国经济社会的发展和人口老龄化的加重，器官衰竭的病人逐年增加，对供体器官的需求量越来越多，而在我国器官捐献数量的远远不能满足移植的需求，很多的病人在等待过程中离世。从其他动物中获取器官用来挽救病人的生命被称为异种器官移植，猪在器官大小、生理功能、伦理问题等方面优于非人灵长类动物，因而被科学家和医生认为是异种器官移植最佳的供体动物。异种免疫排斥是猪器官应用于人类最主要的障碍之一。由于进化上的差异，人类血清中天然存在抗猪的抗体，这些抗体在人类出生后较短时间内增加到与成年人相同的水平。这些天然预存抗体是猪器官移植后面临的第一道免疫学屏障，由这些抗体介导的补体反应并引起凝血反应、招募其他免疫细胞等，导致猪器官的损伤。目前已经找到3个主要的异种抗原基因，包括GGTA1，CMAH和B4GalNT2，三个基因同时敲除后能减少90%的人类血清中IgG和IgM对猪细胞的吸附，但剩余的10%的天然预存抗体结合的猪细胞表面的抗原表位依然未知。利用CRISPR文库筛选技术，我们设计并合成了猪全基因组sgRNA文库，在猪永生化细胞系中进行筛选，以期找到未发现的异种抗原基因。在实验过程中，我们发现持续高表达Cas9会严重影响细胞状态，因此用四环素诱导表达Cas9以降低这种对细胞的负面影响。用PB转座子系统，将PB-rtTA-Cas9-td 随机插入PK15细胞的基因组中，3天后加入四环素，诱导Cas9-Td启动表达，细胞因表达tdTomato而发红光，用流式细胞仪分选出带红色荧光的细胞。经过3次的加药分选后，98%的细胞成功整合了Teton-Cas9-Td。在此细胞基础上，敲除GGTA1、CMAH和B4GalNT2这3个主要的异种抗原基因，提高异种抗原基因筛选的成功率。用猪全基因组文库sgRNA慢病毒感染TKO PB-rtTA-Cas9-td PK15细胞，用嘌呤霉素富集成功整合文库慢病毒的细胞。加入Dox诱导Cas9表达，随机的敲除基因，用不同浓度的人类血清与细胞进行孵育，利用血清中预测的天然抗体介导补体杀伤，幸存的细胞可能是消除了异种抗原的细胞。