H5N1流感病毒NEP/NS2与hNup98、hNup214相互作用介导vRNPs出核的机理研究

流感病毒子代病毒核糖核蛋白复合体（vRNPs）在其出核蛋白NEP(也叫非结构蛋白NS2)的介导下穿越核孔向胞质转运，从而完成子代病毒的装配和出芽。但具体哪些宿主细胞因子参与了vRNPs的出核过程目前还不清楚。课题组通过酵母双杂交、哺乳动物双杂交分析发现并证实H5N1流感病毒NEP/NS2蛋白与核孔复合物（NPC）的组分核孔素hNup98及hNup214存在互作。共定位分析表明hNup98能特异性地招募NEP/NS2到核仁，且发现流感病毒感染能显著下调hNup98的表达，表明NPC蛋白对流感病毒vRNPs的出核非常重要，而且可能是通过与NEP/NS2的互作而实现的。因此本课题拟进一步深入研究NEP/NS2与hNup98、hNup214的互作，揭示NEP/NS2与hNup98、hNup214的互作调控vRNPs出核的机理，为研究针对流感病毒vRNPs出核过程的抗病毒药物提供重要参考和指导意见。

流感病毒基因组在细胞核内复制，NEP/NS2蛋白能够引导病毒vRNPs穿过核孔复合物NPC完成细胞核向细胞质的转运。我们筛选到了核孔素hNup98和hNup214并验证了NEP/NS2蛋白与他们之间存在着相互作用。对NEP-hNup98两个蛋白相互作用所必需的结构域进行了解析。Mapping实验证明，NS2蛋白的N 端区域（氨基酸1-53 ）和hNup98的GLFG 重复区域（氨基酸 1-511 ）是两个蛋白发生结合的关键区域，而且hNup98 正是通过其氨基端GLFG 重复序列将NS2 招募至核仁。Confocal 结果显示NS2-hNup98核仁共定位的发生能够特异性地被leptomycin B （LMB）--hCRM1的专一性抑制剂所抑制；在共表达 NS2、hNup98和hCRM1的HeLa细胞中，NS2和hCRM1同样也能够同时被hNup98招募到核仁位置，以上数据揭了hCRM1 在NS2-hNup98互作中潜在的“桥梁”作用，NS2-hCRM1-hNup98 互作模式的证实提示hNup98 作为一种穿梭蛋白，可能通过为流感病毒 hCRM1-NS2-M1-vRNPs 转运复合底物提供特异性的NPC出核锚点，参与并调控了NS2介导的流感病毒vRNPs的出核。.hNup214蛋白通常存在于NPC的细胞质面，亦富含FG重复序列，其重复区域与核蛋白出核受体hCRM1有很高的亲和力。我们的研究发现A/Chicken/Henan/12/2004（H5N1）流感病毒的感染能显著下调A549感染细胞内hNup214蛋白的表达。在hNup214过表达或knockdown的细胞中流感病毒的复制均受到不同程度的影响。进一步研究数据表明，hNup214可能在流感病毒复制的晚期发挥作用。而且hNup214的FG区域可以将CRM1招募至细胞核，并在流感病毒的复制晚期起重要作用。.本研究以流感病毒与宿主细胞相互作用为出发点，对NEP/NS2与核孔素蛋白hNup98和hNup214的相互作用、相互作用模式及作用机制进行了深入研究，对进一步解析vRNPs的出核机制及针对流感病毒vRNPs出核抗病毒药物的设计提供科学依据。