蛋白质-单链DNA复合体结构解析的NMR/EPR混合型新方法的研究

NMR spectroscopy has been developed into a routine method for solution structure determination of protein monomers, however, this is not the case for protein complexes. As an evidence, the number of complex structures in the Protein Data Bank accounts for less than 5%. In recent years, there has been an increasing emphasis on integrating complementary techniques including PRE, RDCs, EPR and SAXS, into conventional NMR method for structure determination for protein dimers. However, structure reports on the complex of protein-nucleic acids by using this kind of hybrid method are very rare. One major reason for this current situation arises from the severer NMR resonance overlap from nucleic acids than from proteins. To solve the solution structure of the complex consisting of protein and single stranded DNA (ssDNA) as the study goal of this proposal, by introducing paramagnetic shift reagent and paramagnetic relaxation enhancement reagent into either protein or ssDNA, pitfalls for structure determination of the protein-ssDNA complex by NMR alone will be overcome at two aspects: (1) full and correct NMR resonance assignments for ssDNA; and (2) the orientation of ssDNA (5'-3') specified in the complex. This proposed new NMR/EPR hybrid approach for protein-ssDNA solution structure determination will be validated. The structural analysis of protein-ssDNA complex provides insights into understanding of the molecular mechanism between the two subunits, and the way how protein protects ssDNA from degradation by nuclease during the DNA replication and repair progresses in cells. This new hybrid approach for solving the structure of protein-ssDNA complex will benefit the structure study on proteins associated with Z-DNA or dsRNA in future.

应用NMR解析蛋白质单体的溶液结构已成为常规方法，但对蛋白质复合体的结构解析依然有限，在国际蛋白质数据库中的复合体结构还不到5%。近年来，NMR结合PRE，RDCs，EPR和SAXS等方法已广泛用于蛋白质二聚体溶液结构的解析，但有关蛋白质-核酸复合体的报道并不多，其主要原因在于核酸比蛋白质的NMR谱峰重叠更严重。本项目计划以蛋白质-单链DNA复合体为模型，通过引入顺磁位移试剂和顺磁弛豫试剂到蛋白质或单链DNA中，应用NMR结合EPR方法，解决单链DNA的NMR谱峰的完全、准确归属和单链DNA在复合体中的空间取向，建立解析蛋白质-ssDNA复合体结构的NMR/EPR混合型新方法。蛋白质-ssDNA复合体的结构研究有助于理解单体间作用的分子机理，阐明在细胞内DNA复制和修复过程中蛋白质对ssDNA的保护机制。该新方法可以进一步应用到蛋白质与Z-DNA或双链RNA形成的复合体的结构解析。

应用NMR方法解析自由态蛋白质的溶液结构已成为常规方法，但对蛋白质复合体的结构研究往往有所局限，比如化学位移信号谱峰在构象交换处于NMR中等时间尺度时或者复合物分子量较大时引起NMR谱信号消失。本项目以蛋白质-单链DNA复合体为模型，建立研究蛋白质-单链DNA复合体结构的混合型新方法。肺炎链球菌蛋白SP_0782是一种新发现的可能与ssDNA结合的PC4类蛋白，在保护DNA和维持基因组稳定性方面发挥作用。本研究经过深入研究发现，SP_0782二聚体具有保守的PC4样折叠，两个亚基与两条反平行的ssDNA链结合。一个SP_0782二聚体中的两个亚基与ssDNA协同结合，具有较高的亲和力。SP_0782对不同长度的ssDNA表现出不同的结合模式，这是由于在SP_0782中两个主要的DNA结合区域对核苷酸的不同捕获所致。另一方面，SP_0782倾向于在较高的SP_0782:ssDNA摩尔比下与ssDNA形成高分子量的复合物。针对这一现象，本研究提出了一种SP_0782二聚体在结合长链ssDNA时协同作用的高密度结合模型。同时，本研究揭示了原核与真核PC4类蛋白在DNA结合界面的细节差异，显示出一种趋异进化。本研究利用了NMR混合型、高精度研究方法，综合多种技术手段全面揭示了SP_0782-ssDNA相互作用机制，为深入了解SP_0782乃至PC类蛋白的ssDNA结合机制提供了重要的促进作用。本项目中，我们还基于NMR结合SAXS方法，研究了蛋白TGIF1识别特异性DNA，以及Pin1蛋白通过结构域间的作用调节其催化机制，显示了NMR结合其他方法在蛋白质与其他生物分子互作研究中的广泛应用。