ZNF148可变剪切调控Wnt信号通路在结直肠癌侵袭转移中的作用机制研究

The mechanism of tumor invasion and metastasis in colorectal cancer is unknown. With the financial support from a previous National Natural Science Fund project, we find that ZNF148 is a key molecule regulating the invasion and metastasis of colorectal cancer, and exhibits bidirectional regulation effect. ZNF148 has two splice isoforms, ZNF148 full length (FL) and ZNF148 splicing isomer (△N). ZNF148(FL) has a p300 binding domain, but there is no one for ZNF148(△N). ZNF148(△N) can antagonize the function of ZNF148(FL). Down-regulation of ZNF148 (FL) and up-regulation of ZNF148 (△N) result in the inhibition of Wnt pathway. So, we hypothesize that ZNF148 (FL) may promote the invasion and metastasis of colorectal cancer through enhancing the Wnt pathway after combination with p300. Contrarily, ZNF148 (△N) can inhibit this pathway. We plan to validate this hypothesis in molecule, cell, human tissue and whole animal levels, using human colorectal cancer tissue, cell lines, subcutaneously transplanted tumor model and animal model of liver metastasis tumor. We aim to explore the molecular regulation mechanism, using tissue microarray, immunohistochemistry, RT-PCR, lentivirus transfection, luciferase test, Chip test and GST-pull down test. This study may lay a foundation for revealing the mechanism of invasion and metastasis of colorectal cancer from the new viewpoint of ZNF148 alternative spicing.

结直肠癌侵袭转移的机制不明。我们在前一个国家自然科学基金项目的资助下，发现ZNF148可以双向调控结直肠癌的侵袭转移。ZNF148具有两个剪切异构体，即ZNF148全长（FL）和ZNF148剪切体（△N），后者比前者少一个p300结合域，可以拮抗前者的功能。下调ZNF148（FL）或上调ZNF148（△N），Wnt通路均被显著抑制。所以我们提出假设，ZNF148（FL）可能通过结合p300调控Wnt通路，促进结直肠癌的侵袭转移；ZNF148（△N）则可抑制这一通路。为了验证这一假说，本项目将通过人体组织、细胞、皮下移植瘤和肝转移瘤模型，采用组织芯片、免疫组化、RT-PCR、慢病毒转染、荧光素酶实验、Chip实验、GST-pull down实验，从分子、细胞、组织和动物整体水平深入研究调控的分子机制。本研究将从ZNF148的可变剪切这个新视点为揭示结直肠癌的侵袭转移机制奠定基础。

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，早期CRC治愈率高，生存时间长，而中晚期则预后较差。中晚期CRC由于发生了局部浸润和远处转移，局部复发率和远处转移率高，是导致患者治疗失败和死亡的主要原因，且目前尚无有效的防治手段。我们在前期研究中发现，ZNF148可以双向调控CRC的侵袭转移。ZNF148具有两个剪切异构体，即ZNF148全长（FL）和ZNF148剪切体（△N），后者比前者少一个p300结合域，可以拮抗前者的功能。下调ZNF148（FL）或上调ZNF148（△N），Wnt通路均被显著抑制。所以我们提出假设，ZNF148（FL）可能通过结合p300调控Wnt通路，促进CRC的侵袭转移；ZNF148（△N）则可抑制这一通路。为了验证这一假说，我们利用结直肠癌组织芯片库和新鲜冻存的结直肠癌标本，采用Envision免疫组化、Western Blot法和RT-PCR法检测ZNF148(FL)和ZNF148(△N) 蛋白质和mRNA的表达情况，发现从Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期到Ⅳ期，ZNF148(FL)的表达水平均逐渐增高，ZNF148(△N)的表达水平均逐渐降低。细胞学研究显示，从CaCO2、SW480、RKO、DLD-1到HCT116，细胞的侵袭转移能力逐渐增强，ZNF148(FL)的蛋白质和mRNA水平逐渐上升，ZNF148(△N)的蛋白质和mRNA水平逐渐下降。通过下调ZNF148(FL)和上调ZNF148(△N)的表达水平，发现细胞增殖、侵袭转移和体内成瘤能力明显减弱。然后采用Affynix芯片分析筛选，通过IPA信号通路分析，发现Wnt信号通路中的多个分子发生了明显变化。ZNF148（△N）过表达或ZNF148（FL）敲减后，E-cadherin显著上升，而N-cadherin、Vimentin和Fibronectin则显著下降，表明EMT信号通路显著被抑制。最后通过荧光素酶实验、Chip实验和GST-pull down实验，证实了ZNF148的不同剪切体是通过调控p300而影响Wnt通路，进而调控CRC的侵袭和转移。本研究从ZNF148的可变剪切这个新视点揭示了一条新的CRC侵袭转移机制，为CRC的防治做出了贡献。