异位表达钙反向转运体基因提高苹果抗斑点落叶病的机理

Ca2+及Ca2+信号在植物-病原菌互作中起着重要作用。Ca2+/H+反向转运体是调节胞质钙平衡、维持胞质钙低浓度特性的跨膜转运蛋白。我们前期研究发现，异位表达Ca2+/H+反向转运体基因（sCAX）提高了苹果对斑点落叶病的抗性。为了探究其机理，本项目拟利用蛋白质组技术研究转sCAX基因苹果与非转基因苹果受斑点落叶病菌侵染后叶片蛋白质组差异，通过质谱测序和数据库检索，鉴定差异蛋白质功能及其归类。同时，对转sCAX基因苹果细胞Ca2+亚细胞定位、细胞超微结构的变化及斑点落叶病菌侵染叶片后[Ca2+]cyt、抗病相关酶活性、过敏反应和化学保护物质变化与非转基因苹果的差异进行分析。综合以上分析结果，阐明苹果导入sCAX基因对斑点落叶病应答系统和防卫反应的影响，揭示Ca2+/ H+反向转运体在苹果-斑点落叶病菌互作中的调控作用及超表达sCAX基因增强苹果抗斑点落叶病的机理。

通过本研究我们初步揭示了钙信号介导在苹果与斑点落叶病菌（Alternaria alternata apple pathotype）互作中的作用。苹果受A.alternata侵染，不同抗病品种叶片组织超微结构、Ca2+分布及定位差异较大，在抗病苹果中Ca2+内流是细胞质Ca2+上升的主要来源，在感病苹果中细胞器Ca2+释放是细胞质Ca2+的主要来源。通过对苹果全基因组MdCAXs、MdCPK等基因家族的生物信息、基因结构及进化进行分析，苹果MdCAXs 和MdCPKs基因家族分别包含8个和37个成员，MdCAXs基因受外界非生物胁迫和病原菌的诱导，具有组织表达特异性。MdCPKs基因响应病菌诱导，在抗病苹果中比感病苹果中响应时间早而且强烈。.通过苹果-A. alternata互作的转录组学研究，侵染后与侵染前的差异表达基因主要参与生物过程和代谢途径，在侵染早期主要涉及钙信号、SA、JA、BR、ET和ABA信号通路，防御防卫反应及次生物合成代谢相关基因。基于iTRAQ 技术对‘红星’和‘红玉’受A. alternata侵染72 h的差异蛋白进行分析。‘红星’中差异蛋白有328个，上调蛋白数量为112个，下调蛋白数量为216个；在‘红玉’中仅有39个，上调蛋白数量为20个，下调蛋白数量为19个。这些差异蛋白主要富集在代谢途径、次生代谢产物的生物合成、核糖体、光合作用和光合天线蛋白等。分析发现仅出现在抗病品种叶片中的上调蛋白主要包括：抗病相关的内切几丁质酶、脂氧合酶、新薄荷醇脱氢酶、热激蛋白等。仅出现在感病品种叶片中主要为氧化还原相关蛋白，如过氧化物还原酶、超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽S转移酶等，且均出现下调表达。与病程相关蛋白（PR）在二者中均成上调表达，但PR2、PR5等在抗性品种‘红玉’中在未侵染时就有本底表达。这些结果表明，几丁质酶、脂氧合酶、新薄荷醇脱氢酶、热激蛋白，PR蛋白的本底或早期表达在红玉苹果抵抗斑点落叶病菌侵染可能起重要作用。而在红星中氧化还原相关蛋白下调表达可能是其易感病的重要原因。.在本项目资助下，共培养研究生7名，已发表中文核心期刊5篇，SCI 2篇（含已接收），申请专利1项。实验结果在陆续总结待发表中。