aPKC/Par-3/Par-6极性复合物调控足细胞迁移在ANCA相关小血管炎新月体形成中的机制研究

Podocyte migration initiated crescents formation in ANCA- associated vasculitis (AAV). The dysfunction of aPKC/Par-3/Par-6 polarity complex is closely associated with podocyte migration. The rephosphorylation of atypical protein kinase (aPKC) by direct interaction with heat-shock protein 70 is important for stability of aPKC/Par-3/Par-6 complex. Moreover, it has been found that anti-human HSP70 antibody titers in patients with MPO-ANCA positive microscopic polyanitis were significantly higher than those of healthy controls, which is changed in parallel with disease activity. Bearing in mind the rescue mechanism of aPKC by Hsp70 proteins and the fact that aPKC activity is important in the regulation of podocyte polarity and migration, we will establish both mice and podocyte injury model of AAV. The mechanism of podocyte migration and aPKC/Par-3/Par-6 complex dysfunction will be further researched in crescents formation of AAV.

Ⅲ型新月体肾炎主要来自于ANCA相关小血管炎，是临床最常见的新月体肾炎，进展快、预后差。足细胞迁移与新月体形成和慢性化密切相关，因此深入研究新月体形成的新机制，寻找足细胞迁移的调控因子，对于改善肾脏预后具有重要的临床意义。足细胞是高度分化的极性上皮细胞，aPKC/Par-3/Par-6极性蛋白复合物可能与足细胞迁移、新月体形成密切相关。aPKC再次磷酸化障碍是导致该复合物定位和功能异常的关键环节，可能与ANCA相关小血管炎疾病活动期热激蛋白HSP70表达和功能异常有关。申请者拟建立ANCA相关小血管炎小鼠模型和疾病活动期血清诱导足细胞损伤模型，观察aPKC再次磷酸化障碍对足细胞迁移和新月体形成的影响；免疫共沉淀检测HSP70对aPKC再次磷酸化的直接作用；以期为临床防治ANCA相关性小血管炎肾损害提供干预靶点和理论基础。

ANCA相关小血管炎肾损害是临床最常见的新月体肾炎，进展快、预后差，是肾脏病领域的急危重症。新月体形成并纤维化是ANCA相关小血管炎肾损害发生发展的核心病理改变。既往研究提示足细胞迁移与新月体形成和慢性纤维化密切相关，因此深入研究足细胞参与新月体形成的机制，寻找ANCA相关小血管炎肾损害治疗靶点，对改善肾脏预后具有重要的临床意义。我们利用免疫损伤构建ANCA相关小血管炎肾损害小鼠模型，通过病理和临床生化指标证实动物模型造模成功；通过透射电镜、免疫荧光技术、肾脏病理染色观察小血管炎肾损伤新月体形成过程中足细胞迁移能力的获得。实验结果显示，新月体形成过程中可以观察到足细胞间紧密连接的破坏，肾组织中RhoA/Rac/Cdc42活性增强，肾组织足细胞aPKC/Par3/Par6蛋白复合物表达减弱。使用TNFα单抗治疗小血管炎小鼠模型能够有效抑制新月体形成，下调肾组织RhoA/Rac/Cdc42活性，增加足细胞aPKC/Par3/Par6蛋白复合物表达。为进一步说明TNFα单抗抑制新月体形成的机制，我们提取小鼠原代足细胞，分别给予ANCA相关小血管炎患者疾病活动期血清、TNFα刺激足细胞，建立干预稳定的细胞模型。通过足细胞划痕实验和Transwell实验检测疾病活动期血清和TNFα对足细胞迁移的影响。细胞实验证实了疾病活动期血清和TNFα均能导致aPKC/Par3/Par6蛋白复合物从足细胞膜上解聚并脱落。分别应用PKCλ特异性激动剂和拮抗剂、HSP表达质粒和siRNA调控aPKC磷酸化水平，我们观察到aPKC磷酸化障碍能影响足细胞aPKC/Par3/ Par6极性复合物的定位表达，并诱导足细胞迁移增强。为进一步说明疾病活动期血清和TNFα通过分子开关aPKC磷酸化影响足细胞迁移的机制，我们通过免疫共沉淀实验发现了aPKC与HSP70之间的直接作用，证明了小血管炎肾损伤进展中HSP70表达下调，导致aPKC磷酸化障碍、足细胞aPKC/Par3/Par6极性复合物丢失可能是ANCA相关小血管炎肾损害足细胞迁移、新月体形成关键机制。