内皮细胞源性外泌体介导microRNA靶向TAK1调节皮肤衰老的分子机制

Transforming growth factor-β activated kinase 1(TAK1) is very important for maintaining skin homeostasis. Inhibit TAK1 activity will lead to the occurrence of apoptosis, promote skin aging. In our preliminary study, we found that the endothelial cells involved in the regulation of skin aging process. Through bioinformatics, we screened 22 upregulated miRNA targeting TAK1 activity from senescence endothelial cells. Therefore, we assume that the aging of skin fibroblasts can be affected by miRNA of exosomes derived from endothelial cells through targeting TAK1 activity of fibroblasts. At firstly, this study will confirme aging endothelial cell can promote skin fibroblasts apoptosis by inhibiting TAK1 activity; then identify 2-3 miRNA targeting TAK1 activity from exosomes derived from senescence endothelial cells and clarify their molecular mechanisms in aging. At last, through the establishment of endothelial cell-specific miRNA transgenic mice, we further validate endothelial cells influence skin aging through miRNA of its exosomes. This study will provide new drug targets for delaying skin aging and skin aging-related diseases treatment.

TAK1对维持皮肤稳态非常重要，抑制TAK1活性将导致细胞凋亡的发生，促进皮肤衰老。前期研究工作中，我们发现内皮细胞也参与调节皮肤衰老的过程。我们通过生物信息学方法，从衰老内皮细胞上调表达的miRNA中筛选出22个靶向TAK1活性的miRNA。外泌体可将miRNA传递给靶细胞并影响其功能。因此我们假设，衰老内皮细胞可以通过外泌体介导miRNA靶向调节皮肤成纤维细胞TAK1的活性，促进细胞凋亡，从而影响皮肤衰老的进程。本研究首先将在细胞共培养体系中证实衰老内皮细胞可以通过抑制TAK1活性促进皮肤成纤维细胞的凋亡；然后从衰老内皮细胞外泌体中鉴定2-3个靶向TAK1活性的miRNA，阐明其调节成纤维细胞衰老的分子机制；并通过建立内皮细胞特异性miRNA转基因小鼠模型，进一步验证内皮细胞通过外泌体介导miRNA对皮肤衰老的影响。本研究将为延缓皮肤衰老及皮肤衰老相关疾病的治疗提供新的药物靶点。

本项目探讨衰老血管内皮细胞是否可以通过外泌体介导miRNA调节皮肤成纤维细胞的衰老进程，并进一步分析衰老血管内皮细胞来源的外泌体miRNAs调节皮肤成纤维细胞衰老的具体分子机制。本项目分析了衰老皮肤组织中miRNA的表达谱，其中miR-302b-3p具有调节皮肤成纤维细胞衰老的作用。同时，本项目通过D-半乳糖诱导的建立血管内皮细胞衰老模型，通过共培养体系，证实衰老血管内皮细胞共培养后的皮肤成纤维细胞衰老阳性细胞数目增多、凋亡阳性细胞数量减少、增殖细胞数量减少。然后分析单独培养的衰老血管内皮细胞以及单独培养的皮肤成纤维细胞中衰老相关miRNAs的表达情况，并结合血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养模型，发现miR-326-3p及miR-767可通过内皮细胞外泌体途径使皮肤成纤维性细胞中miR-326-3p及miR-767表达上调。实验还证实衰老血管内皮细胞外泌体中兴趣miRNAs的表达上调，外泌体miRNA-326-3p示踪分析也证实其可被成纤维细胞摄取。分别提取对照与衰老血管内皮细胞外泌体直接干预皮肤成纤维细胞，实验发现衰老血管内皮细胞外泌体使皮肤成纤维细胞衰老阳性细胞数目增多、凋亡阳性细胞数量减少、增殖细胞数量减少。分别将miR-326-3p及miR-767 mimic或 inhibitor转染皮肤成纤维细胞，建立兴趣miRNA过表达或低表达细胞模型，证实miR-326-3p及miR-767过表达分别可以使皮肤成纤维细胞衰老阳性细胞数目增多、凋亡阳性细胞数量减少、增殖细胞数量减少。利用生物信息学软件TargetScan分析miR-326-3p和miR-767的靶基因，实验证实miR-326-3p过表达可以使靶基因TLR4基因及蛋白表达下降，miR-767过表达可以使靶基因TAB1基因及蛋白表达下降，双荧光素酶报告基因实验也进一步证实miR-326-3p 与靶基因TLR4的靶向关系和miR-767与靶基因TAB1的靶向关系。进一步实验证明，TLR4及TAB1低表达后皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数量显著增加。最后，采用外泌体抑制剂GW4869背部皮肤皮下注射干预衰老小鼠一个月，发现G24869干预后皮肤组织TLR4及TAB1基因表达显著高于衰老对照组。本研究提示衰老血管内皮细胞可经外泌体介导miRNA调节皮肤衰老的过程，本研究为抗皮肤衰老的药物靶点研究提供了实验依据。