基于化学小分子研究STAT3与心力衰竭相关靶基因RLX的相互作用及信号转导的调控规律

以化学小分子为探针，针对与心力衰竭相关的信号转导分子－STAT3及其靶基因RLX 开展多学科的研究。研究内容包括：设计合成或探寻(天然产物分子)对STAT3、STAT3与RLX基因的结合序列(双链DNA)以及RLX基因的G-四链体具有选择性识别功能的新型化学小分子探针；利用分子生物学技术，探测化学小分子选择性干预STAT3信号转导和调控STAT3与RLX基因相互作用的功能；观测细胞增殖、肥厚等细胞表型在化学小分子探针加入前后发生的变化。期望发现选择性高的化学小分子探针，揭示STAT3与靶基因相互作用及信号转导的调控规律,为心力衰竭的早期防治提供新的线索和理论依据。本项目不局限于对STAT3的调控，而是将思路扩展到STAT3的靶基因。特别是在与心力衰竭相关的信号转导研究中,提出以双链和G-四链体DNA作为探针分子的靶点,探讨信号转导过程和调控规律，是具有重要学术意义的创新研究策略。

本项目开展了对STAT3及其靶基因RLX G-四链体具有识别功能的化学小分子的合成和筛选。设计和合成了寡聚酰胺、二萘嵌苯和噁唑环肽衍生物等化学小分子探针；分析了200多个化学小分子对STAT3和RLX 基因G-四链体的识别性能，发现了四个柔性大环分子和五个弯月状小分子具有选择性识别G-四链体DNA的功能，为信号转导的研究提供重要探针分子。. 采用ESI-MS、NMR、CD和DMS印迹方法研究了与STAT3信号转导相关的富G序列特殊二级结构G-四链体的形成和构象，使用聚合酶停止实验证明了STAT3基因启动子区形成G-四链体结构后，可阻碍聚合酶的正常滑动。. 研究了STAT3与靶基因RLX的相互作用及化学小分子对其信号转导的影响。使用高分辨NMR波谱研究了STAT3下游靶基因RLX启动子区富G序列的性质，发现这段富G序列可以形成特殊的G-四链体，利用分子模拟的方法构建并优化了RLX G-四链体的理论结构模型。发现天然小檗碱和两面针碱可以高亲和性地结合RLX启动子区G-四链体，显著提高G-四链体的稳定性。构建了FRQ（将RLX启动子区的富G序列插入到报告基因载体质粒上）和 MutQ（将富G序列中的部分G替换为T使之不能形成G-四链体）二个质粒，并使用萤光素酶报告基因，实时 (Real-time) PCR 等方法探讨了G-四链体的形成和化学小分子对RLX基因活性的影响。发现RLX G-四链体的形成以及小分子稳定G-四链体可以上调RLX基因的表达。为了进一步研究G-四链体对RLX表达的影响，進行了染色质免疫共沉淀实验，结果表明小檗碱能抑制STAT3与RLX的结合，促进RNA聚合酶PolⅡ与RLX的结合，上调RLX基因的表达，从而影响STAT3的信号转导。. 发现天然生物碱小分子与STAT3 G-四链体具有较高的亲和性，研究了生物碱小分子的生物活性。研究结果表明：在千金藤素分子的作用下，野生型STAT3质粒 (FRQ) 表达的荧光素酶活性受到抑制，而删除了富G序列的质粒（DelQ）和定点突变富G序列的质粒（MutQ）所表达的荧光素酶活性未受到抑制；并发现此小分子能够剂量依赖地抑制心肌细胞和肿瘤细胞STAT3的表达，影响STAT3的信号转导。