红树植物抗重金属特性及其类金属硫蛋白基因的克隆与表达

以红树植物木榄、白骨壤等为研究对象，开展在多种重金属胁迫下红树植物的膜脂质过氧化作用和体内活性氧清除系统中的保护酶的变化与影响研究；采用RACE（Rapid amplification of cDNA ends）和PCR技术，克隆红树植物抗重金属相关基因-金属硫蛋白（Metallothionein, MT）基因，通过NCBI的BLAST搜索和CLUSTAL W比对，分析MT结构；利用具有T7强启动子pET载体，将MT基因重组并转化到大肠杆菌BL21表达，进行了转化子抗重金属性能的研究该基因在红树植物抗重金属中的作用，利用实时定量PCR方法，探讨秋茄KcMT-II、桐花树Ac MT-II和白骨壤AmMT-II的表达与逆境存在的应答关系，从分子水平上揭示红树植物的抗重金属的分子机理。

本研究主要以红树植物木榄、秋茄等为对象，对红树植物木榄、秋茄等抗重金属特性的生理与生化特征研究表明：与其它红树植物相比，秋茄的抗氧化酶系统比木榄的更为敏感，几种酶活性变化（SOD、POD、MDA）更为显著，抵抗重金属胁迫的能力更强；在最高浓度复合重金属胁迫下，秋茄和木榄的抗坏血酸含量和谷胱甘肽还原酶活性显著减少。采用RACE和PCR技术，克隆了木榄和秋茄抗重金属相关基因—金属硫蛋白（Metallothionein，MT）基因（bMT和kMT），序列长度分别为683 bp和728 bp，都以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，且都包含一个编码79个氨基酸的翻译阅读框（ORF）；分析编码的氨基酸序列表明，bMT、kMT的蛋白为Ⅰ类type 2 MT，其N-和C-端中的半胱氨基酸都以Cys-Cys, Cys-X-Cys 和 Cys-X-X-Cys形式分布；其中木榄、秋茄与模式植物拟南芥中典型的MT-II相似度分别为70%和69%。利用具有T7强启动子pET载体，将kMT和bMT克隆转化到具有T7强启动子的大肠杆菌BL21表达，发现同一转化子对不同的重金属的抗性存在差异，不同转化对同一重金属的抗性也不相同，在红树植物抗重金属中起作用也间接地证明了该基因不仅对必需重金属具有调节功能，而且还提红树植物对重金属的抗性，减少对植物的胁迫。利用实时定量PCR方法，结果表明秋茄（KcMT-II）、桐花树（Ac MT-II）和白骨壤（AmMT-II）的表达量受到Zn、Cu、Pb和Cd的调节，但它们调节模式是不同的。在有些实验条件下，KcMT2、BgMT2和AmMT2的表达量与对照相比明显增高，表明KcMT-II、Ac MT-II和AmMT-II的表达与环境存在的应答关系，且重金属胁迫下木榄和秋茄MT-II具有多种表达模式，即不同金属具有不同表达模式。同样，在重金属、干旱和低温等逆境条件胁迫下，发现红树植物秋茄肉桂酸-4羟化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）基因和锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD）基因同样也有表达和调控，这说明红树植物在同一逆境条件下受多个功能基因的调控。该研究初步从分子水平上阐述了红树植物的抗重金属机理，为揭示了红树植物抗逆分子生态学特征奠定了基础。