生物活性陶瓷促进IPS细胞基因表达和成骨分化机制的研究

Bioactive Ceramics is the first choice scaffold for bone tissue engineering .The previous research proves that the extract of calcium-silicon-magnesium system ceramic such as akermanite can increase the proliferation, gene expression and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Animal experiments also indicates that this kind of ceramic can improve bone regeneration. But the function and mechanism of each component in calcium-silicon-magnesium system is unclear. The project is devoted to a systematic study of the relationship of ceramic composition and extract ion concentration in calcium-silicon-magnesium system, as well as the influece law of the microenvironment of different ions on the proliferation and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. We will study the corresponding gene expression profile of bone marrow mesenchymal stem cells using gene chip technology, to find out the possible geng that directly affect the calcium, silicon and magnesium ions or their combinations in the activation process of IHH and WNT signaling pathway.We will prove the effect of ceramic system on the tissue regeneration through the animal model and elucidate the mechanism of the ion micro-environment in the calcium-silicon-magnesium system regulating human bone marrow mesenchymal stem cell growth, differentiation and osteogenesis, to provide a basis for designing and developing a new bone tissue engineering materials.

生物活性陶瓷是骨组织工程首选支架材料之一。硅酸盐生物活性陶瓷与iPS的相互作用尚未见报道，本项目拟首先在体外诱导iPS细胞向成骨细胞分化，观察iPS细胞体外诱导分化的能力，然后在前期成功研制了硅酸盐生物活性陶瓷材料的基础上，将iPS细胞与生物材料复合，研究材料对iPS细胞生长增殖和成骨分化的影响，通过利用硅酸盐生物活性陶瓷体系，考察硅酸盐生物活性陶瓷对iPS细胞命运的调控规律及分子机制，分析生物材料微环境对于成骨再生的影响，更系统地建立干细胞命运和生物材料特性之间的关系，更深入地理解决定干细胞命运的机制，从分子水平上阐明硅酸盐生物陶瓷材料的组成与iPS细胞成骨分化及骨再生的关系及其作用机理，为iPS在骨组织工程中的应用奠定理论基础，为设计开发新型骨组织工程材料打下基础。

目的背景：诱导性多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cells (iPSCs) ）作为种子细胞在组织工程应用中具有非常大的潜能。先前的研究结果证实iPSCs可以诱导分化成骨。组织工程，种子细胞是重要因素，而在新生组织生长过程中支架材料微环境对种子细胞的增殖、分化的影响同样重要。因此在此实验中，我们利用镁黄长石，硅酸盐生物活性陶瓷材料，研究其体外体内诱导刺激iPSCs成骨分化。 .主要研究内容：（1）人iPSCs多能性鉴定，包括碱性磷酸酶染色、细胞核型检测、多能性基因免疫荧光染色、畸胎瘤实验、三胚层组织细胞苏木精&曙红染色。（2）体外生长培养基对比不同浓度镁黄长石浸提液（1/32、1/64、1/128、1/256）作用于人iPSCs细胞免疫荧光染色检测细胞多能性基因，另外生长培养基组、成骨诱导因子组、镁黄长石浸提液各浓度组作用于人iPSCs细胞分化来源拟胚体细胞，在第7天细胞碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性检测，第14、21天检测成骨相关基因，第21天同时进行茜素红染色。（3）体外三维条件支架材料接种人iPSCs细胞，第14天进行茜素红染色及成骨相关基因检测。（4）免疫组化染色、micro-CT检测支架材料接种人iPSCs细胞裸鼠皮下成骨及修复裸鼠颅骨缺损。.重要结果：（1）我们看到人iPSCs鉴定结果符合诱导性多潜能干细胞要求。（2）在成骨诱导因子条件下，材料浸提液的成骨诱导作用优于单纯成骨诱导液作用。在一定浓度范围的材料浸提液刺激下， ALP活性及成骨相关基因检测结果显示OCN、COL1、RUNX2、BMP2的表达明显高于对照组。而当镁黄长石浸提液不含成骨诱导因子时，相比于生长培养基成骨分化在早期没有变化，在分化后期第21天成骨分化增强。（3）支架材料接种人iPSCs细胞PLGA+10%Aker+C组培养下矿化基质阳性及成骨相关基因检测均高于PLGA+C组及PLGA+20%Aker+C组。提示我们PLGA+10%Aker镁黄长石复合支架可以用来进一步进行动物体内试验。（4）支架材料接种人iPSCs细胞PLGA+10%Aker+C组裸鼠皮下及修复颅骨缺损均优于其他各组。.结论：在不含成骨诱导因子体外二维三维条件下镁黄长石生物活性陶瓷对人iPSCs成骨分化有促进作作用，同时体内试验提示其作为支架材料联合人iPSCs在骨组织工程中的应用。