养阴清热、活血解毒方通过甲基化修饰调控Th17/Treg干预AS免疫炎症的分子机理

Increasing studies have demonstrated that atherosclerosis(AS) is a chronic immunoinflammatory disease. Currently it is known that chronic immune inflammation exist throughout the whole pathogenesis process of AS. Th17/Treg imbalance is an important incentive for the process. Treg functions are closely controlled by FOXP3 gene methylation. 'Yangyin Qingre Jiedu Huoxue Decoction(YHF)'was established on the basis of clinical treatment of AS with years of experiences. Our preliminary studies suggested that YHF can affect regulatory T cells (Treg) and T helper cell subsets (Th17)-related cytokines. It can be postulated according to these founding that YHF may affect complex pathological state of AS through the methylation modification and the reconstruction of Th17/Treg balance. This project intends to use self antigen (mHSP65) or infection (LPS) to induce different atherosclerotic pathology of ApoE-/- mice, further interprets the mechanisms of YHF and three decoction unit of nourishing Yin, activating blood circulation and clearing heat for the regulation of Th17/Treg balance and the intervention of Foxp3 methylation, with the aid of these methods of epigenetic, immunology and molecular biology. This study will comprehensively elaborated the epigenetic and immunological connotation of therapy for AS with nourishing Yin, activating blood circulation and clearing heat, and the concept of comprehensive balanced regulation of chronic complex diseases with traditional Chinese medicine compound.

目前已知慢性免疫炎症贯穿于动脉粥样硬化(AS)发病全过程，Th17/Treg失衡是重要诱因，foxp3基因甲基化控制着Treg的功能。本课题组依据临床治疗AS的多年经验创立了养阴清热、活血解毒方（YHF），初步研究表明其可影响Treg和Th17相关细胞因子。由此提出科学假说：YHF通过甲基化修饰，重建Th17/Treg平衡来干预AS的复杂病理状态。本课题拟采用表观遗传学、免疫学和分子生物学等方法，结合自身抗原（mHSP65）或感染（脂多糖）复制ApoE-/-小鼠不同类型的免疫炎症，系统探明YHF及其养阴、活血及清热功效单元调控Th17/Treg平衡，调节foxp3甲基化的机制。预期研究成果将阐释治疗AS的YHF及养阴、活血及清热功效的表观遗传学和免疫学科学内涵，为中医临床治疗AS疾病提供理论基础（新机制）。

动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）以动脉壁脂质堆积为特点，是一种慢性炎症性疾病。养阴清热、活血解毒方（YQHP），即江苏省中医院内制剂“芦黄颗粒”，来源于江苏省名中医经验方。YQHP从“瘀热”立论，临床应用多年，但作用机制尚未明确。本课题组前期研究显示，T细胞亚群的Treg/Th17平衡可能是YQHP改善AS的内在原因，其中涉及YQHP对Foxp3甲基化的调控。本项目首先构建了高脂、高脂复合热休克蛋白（HSP）65、高脂复合LPS三种不同致病因素引起的ApoE-/-小鼠AS模型，研究YQHP及其功效单元对不同致病条件下的AS形成的影响。随后，运用免疫学、分子生物学等方法对AS小鼠血脂、炎症水平、Treg/Th17细胞平衡状态及其特征性转录因子Foxp3/RORγt表达水平进行检测分析，并分析YQHP不同功效单元的作用。然后，磁珠分选小鼠脾脏CD4+T细胞并进行体外培养，观察YQHP水提液及其有效成分对Treg/Th17分化、Foxp3/RORγt表达的影响，进一步探讨YQHP调节Treg/Th17平衡的内在机制。最后，检测小鼠脾脏及体外培养CD4+T细胞中甲基化转移酶(Dnmts)对Foxp3表达的影响，并研究YQHP防治AS过程中对甲基化修饰的影响。以上研究结果表明，YQHP能够减轻不同致病条件造成的AS小鼠主动脉斑块形成及冠脉壁增厚，调节血脂、减轻炎症，重建Treg/Th17平衡，增加Foxp3表达而减少RORγt表达，且YQHP的养阴、清热、活血三个功效单元作用各有侧重。体外CD4+T细胞实验显示，YQHP水提液能够增加Treg数量，减少Th17比例，同时增加Foxp3的表达而减少RORγt的表达，其中涉及JAK/STAT3信号的变化。YQHP有效成分白藜芦醇能够对CD4+ T细胞的增殖/活化产生抑制作用，这种作用是与Dnmts水平下调，Foxp3表达水平增加相关的，这在体内实验也得到了验证。这些结果表明，干预甲基化修饰是YQHP治疗AS的内在机制。本研究阐明了在AS的不同诱导条件下，YQHP及其功效单元干预疾病进程的内在机制，为其临床应用提供了更多理论依据，支撑了中药复方全面平衡调节复杂慢性疾病的理念，并为AS的防治提供了新的思路。