Baeyer-Villiger单加氧酶Hinge结构的功能及其控制C-C/C-H键活化的分子机制

Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) is one of the best choices for catalytic synthesis of chiral ester and lactone compounds because of its excellent stereoselectivity. Based on the analysis of BVMO crystal structures, it is hypothesized that the two hinge regions linking FAD and NADPH domains may play an important role in the substrate recognition and catalytic oxidation process. Our previous studies have shown that some amino acid residues in the hinges may significantly affect the catalytic properties of BVMO, and even control the function conversion from C-C to C-H bond activation. In this project, to fully understand the function of the hinge structures in BVMO, a comprehensive evaluation for the activity and selectivity of hinge mutants will be performed. Furthermore, the molecular mechanism in controlling C-C/C-H bond activation by the hinge structure will be unraveled by using isotope tracking and molecular dynamic simulation analysis. This study will provide theoretical supports and practical examples for directed evolution of BVMO and better understanding the relationship between structure and function of proteins.

Baeyer-Villiger单加氧酶（Baeyer-Villiger Monooxygenase,BVMO）作为一种生物催化剂，以其出色的立体选择性成为合成手性酯和内酯化合物的最优选择之一。根据晶体结构分析，连接BVMO两个结构域（FAD和NADPH结构域）的两段铰链结构（Hinge）可能在酶催化过程中起重要作用。前期的研究表明Hinge结构中的关键位点不仅能够影响酶的催化性质，甚至控制着酶催化功能的转换——从C-C键到C-H键活化。本项目拟系统研究Hinge突变体对底物的活性、选择性等的影响，揭示Hinge结构在底物识别、不对称氧化中的功能；通过稳定同位素示踪等方法研究关键位点突变体催化功能转换的化学反应机制，并结合分子动力学模拟揭示酶催化性质差异的结构与动力学基础。本课题将为深入理解蛋白质的结构和功能的关系以及BVMO的定向分子进化提供理论支撑和实际例证，具有重要的研究意义

生物催化的BV氧化反应主要是通过Baeyer-Villiger单加氧酶（Baeyer- Villiger monooxygenases，BVMOs）来完成，BVMOs不但催化链酮或环酮转化成相应的酯或内酯，还能够催化硫、氮、硒、磷等杂原子的亲电氧化，从而生成重要的药物中间体。因此Baeyer-Villiger单加氧酶在有机合成中具有重要的理论研究和应用价值。在BVMO家族中，研究多的是底物谱较广的环己酮单甲氧酶（CHMO）和热稳定性强的苯基丙酮单甲氧酶(PAMO)，这类酶依赖FAD和NAPDH作为辅因子再生系统，催化O2中的一个氧原子插入到C-C键中，从而实现C-C键的活化。分析BVMO的基因序列和晶体结构发现存在于底物结合口袋附近的两条Hinge结构（HingeⅠ和HingeⅡ结构）将FAD 与NADPH 结构域连接起来，而且其部分氨基酸残基位点参与了酶的催化过程。因此深入理解Hinge结构在酶催化过程中所扮演的角色具有重要的研究意义。我们以PAMO中的Hinge结构作为研究对象，构建了丙氨酸扫描突变体和缺失突变体，考察了突变体在催化链状酮、脂环酮和芳香酮等方面的差异。结果表明Hinge结构突变体在催化选择性、蛋白表达量以及热稳定性方面与野生菌株无明显区别。HingeⅠ结构主要表现在酶催化活性的升降，而HingeⅡ结构中的G388A催化2-苯基环戊酮生成羟化产物2-羟基-2-苯基环戊酮，这表明G388A失去Baeyer-Villiger氧化活性，具备了环氧化物酶的活力。在实验结果的基础上，推测G388A催化2-苯基环戊酮经过了烯醇化，环氧化物水解开环以及脱水的反应历程，并通过HNMR，不同pH值和同位素示踪等方法验证了提出的反应机制。随后，388位点饱和突变体催化2-苯基环戊酮时都只生成2-羟基-2-苯基环戊酮的结果表明388位点是决定酶催化功能改变的关键位点，从而实现了C-C键到C-H键的活化。分子动力学模拟研究进一步阐明了酶催化功能改变的内在依据，辅助验证了所提出的反应机制的合理性。通过该项目的研究，对于我们认识Baeyer-Villiger单甲氧酶中Hinge结构的功能有进一步的提高。本研究将为深入理解酶的结构与功能的关系，并为酶的进化研究提供理论指导和实际例证，具有重要的研究意义。