针灸抗CTX化疗小鼠骨髓抑制的notch信号调控研究

根据我们前期已有的针灸抗骨髓抑制的研究基础以及Notch信号通路的研究进展，提出"Notch信号通路是针灸对抗骨髓抑制、增强免疫、改善造血等综合作用的关键机制"假说。本项目利用生物芯片筛选、实时荧光定量PCR法验证CTX化疗荷瘤小鼠与非荷瘤小鼠骨髓造血细胞中Notch信号网络相关差异基因，应用免疫组化法、western blot法验证差异基因的蛋白表达及分布规律，并分析其与免疫和造血因子的关系，阐释针灸对抗化疗药物不良反应综合效应的微观机制，并且通过观察针刺与艾灸在不同时段的调控作用，促进针法与灸法不同作用环节及其规律的研究，丰富针灸的科学内涵。也为针灸治疗病理性造血损伤相关疾病提供实验依据。

本项目以与骨髓造血细胞发育过程中影响造血干／祖细胞的生存、增殖和分化方向以及与机体免疫有关的Notch信号通路为切入点，分为正常小鼠和荷瘤小鼠两大组，用环磷酰胺（CTX）建立化疗所致骨髓抑制小鼠模型，分别给予针刺、艾灸治疗并与模型和空白组对照。应用小通量基因表达谱芯片初步筛选各组小鼠骨髓造血细胞Notch信号通路相关差异基因；免疫组化法进一步筛选Notch信号通路相关差异基因；Realtime-PCR方法分析不同组别小鼠骨髓造血细胞Notch信号通路差异基因mRNA的变化；Western-Blot法进一步验证不同组别小鼠骨髓造血细胞Notch信号通路差异基因的蛋白表达；并应用ABC-ELISA法检测了与骨髓造血干／祖细胞的增殖、分化、向外周血释放以及与机体免疫功能等密切相关的血清粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素7（IL-7）、白介素18（IL-18）以及脾脏中环磷酸腺苷cAMP、环磷酸鸟苷cGMP、cAMP/cGMP等指标；通过对上述指标变化规律及相关性分析，阐释针灸保护造血干细胞，减轻骨髓抑制，提升白细胞数量与骨髓造血细胞Notch信号通路相关基因和蛋白表达的关系，其关键机制可能是：对于烷化剂化疗所致骨髓损伤，针灸可以上调骨髓组织中numb蛋白（numb1、numb2）的表达，同时下调notch2、jagged1的蛋白表达，从而抑制过度激活的Notch信号通路，减轻因化疗引起的骨髓抑制。通过针灸治疗，可以提高血清IL-7、IL-18的含量，上调notch信号通路的上游基因numb1/2，同时下调过度激活的notch信号通路上的notch2、jag1，而且能够增加集落刺激因子（G-CSF、GM-CSF）含量及活性，促进造血干细胞的分化；且针刺和艾灸，可以增加血清IL-7、IL-18和脾脏cAMP、cGMP的含量，提高cAMP/cGMP的比值，从而增强机体的免疫功能，减轻因化疗造成的机体免疫功能损伤。本课题的研究结果，验证了“Notch信号通路是针灸对抗骨髓抑制、增强免疫、改善造血等综合作用的关键机制”之假说。