基于微流控芯片的线粒体外膜透化信息提取和模型研究

We employed the microfluidic chip to produce the concentration gradient of the curcumin to stimulate the MCF-7 cells to apoptosis.By observing the mitochondrial outer membrane permeabilization(MOMP) during the apoptosis process of the cells, a mcirofluidic chip based drug screening system by means of statical analysis of cells population was successfully constructed.According to the recent literature, more and more complicated signaling pathways were acquired during the research of the apoptosis mechanism of cell. Our system, however, only incorporated the "On/Off" logical status of MOMP occurrence to screening the effectiveness of certain drug. Thus, the current proposal aims to incorporate the outstanding feature of the microfluidic chips which can accurate delivery of drugs, both spatially and temporally, to aqcuire the information of cellular distribution of several important molecules located in the intermembrane space of the mitochondria during MOMP related cell apoptosis and to modeling the MOMP process in the cell. The "delay effect" and "switch effect" of the MOMP and whether they are related to the concentration of the drug are proposed to be illustrated. The proposed research are promising to provide accurate and quantitative criteria for anti-cancer drugs, which has significance in scientific research and prospect in applications.

我们采用微流控芯片产生姜黄素等药物的浓度梯度，促使在其中长时间培养的人乳腺癌细胞MCF-7凋亡，通过观察细胞凋亡过程中线粒体外面透化（MOMP）的现象，在细胞群体统计分析的意义上建立起了一套基于微流控芯片的药物筛选平台。通过进一步的文献调研和分析发现，生物学研究者在研究细胞凋亡机制的过程中，实验所获的信号通路变的越来越复杂，而我们现有的平台仅仅包含了MOMP"有/无"发生的逻辑二值化信息。因而，本申请着眼于利用微流控芯片精确的药物激励和连续的灌流培养特性，通过实验获取MOMP相关的细胞凋亡过程中线粒体膜间几种重要分子在细胞内分布的时间和空间信息，从而建立MOMP在细胞内部的动态模型，力图揭示MOMP产生过程中的"延时效应"、"开/关效应"是否和药物的激励浓度和种类有着对应的关系。这一研究可以为抗癌药物的作用提供一定的量化衡量指标，建立更加精确"效能"信息，具有一定的科学意义和应用前景。

本项目的研究计划以微流控芯片的精确细胞输送、俘获和药物激励为硬件工具，以基于图像处理方法的信息提取为软件工具，力图结合这两个工具研究细胞线粒体外膜透化过程中的图像信息提取问题。因而项目在执行过程中，主要包含了两大部分的研究内容：（一）微流控芯片的设计与加工及片上微压力调节系统的设计与实现；（二）亚细胞结构荧光图像分析方法。. 为了实现细胞操作以及药物作用，项目采用三维流体聚焦技术。我们独立的提出了基于多层软光刻的内嵌喷口用于实现三维聚焦系统，该方法与文献[3]的报道类似，但在加工的细节上略有不同。该结构可以在微流体芯片中实现稳定、可控的两相三维聚焦，特别是气（连续）-液（分散）两相的聚焦。通过调节两相的流量和压力，可以精确的控制液束宽度，实现单细胞的排队和输送。同时这一方法也可以广泛应用于化学合成压微米级颗粒，以及片上聚焦质谱离子源等，具有较好的应用价值。. 针对本项目多通道高精度驱动问题，我们进一步研究了片上驱动及微压力调节系统。在3位PDMS（polydimethylsiloxane）薄膜微阀的基础上，我们设计了一个完整的片上精确调压系统的原型。该系统主要包含一个3位PDMS薄膜微阀以及一个片上挤压装置，另外还包含一个PDMS薄膜容腔用于滤波。通过直接图像测量方法，我们研究了PDMS薄膜容腔的特性。. 根据本项目的图像分析需求，为了在宽场照明的条件下实现近似于共焦成像的清晰度，又尽量避免强光下的光漂白，适合于微流控芯片的连续培养和成像，需要搭建一套高灵敏度、高精度宽场荧光显微镜的z轴扫描及三维解卷积成像系统。由于计算中涉及大量三维卷积操作，因此使用GPU加速。实验结果表明，随着参与运算的图片数量的增多以及图片尺寸的增大，CPU和GPU运行速度差距越来越明显。在1024x1024大小、9张图片的情况，GPU运行的速度已经是CPU的160倍多。. 针对项目所需的荧光图像信息提取，本项目研究了基于水平集分水岭结合的细胞图像分割方法。在基于地形距离函数优化以及四色原理填充的基础上，测试了利用加性算子分裂方法、距离正则化以及反应-扩散方法提高算法的收敛性和稳定性。.