用纳米金探针检测卵巢癌线粒体DNA突变的研究

卵巢癌是女性生殖器中最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤的第一位，缺乏有效的早期检测手段。线粒体DNA的高突变率以及在癌细胞中的高拷贝数使其成为肿瘤非侵入性诊断的有效分子标记。本项目的目标是建立一种检测卵巢癌线粒体DNA突变的新方法，简化DNA突变的检测过程，使检测灵敏度和准确性大大提高。项目以几种不同来源的标本（卵巢癌组织、血液、腹腔液、卵巢癌细胞系）为研究对象，在卵巢癌突变热点集中的16S、12SrRNA基因、Cytb基因和D-loop区域针对不同类型的线粒体DNA突变设计寡核苷酸探针，用纳米金-寡核苷酸探针可以同时检测线粒体DNA多个突变。并探索纳米金粒径大小、核酸探针序列、密度和长度、反应温度、反应体系盐浓度和pH值、靶DNA等因素对纳米金探针检测线粒体DNA突变效率的影响，为卵巢癌的早期诊断、治疗以及预后的判断提供一个简单、快速的新工具，具有良好的临床应用前景。

本研究用纳米金比色法和石墨烯-DNA水凝胶电极巧妙地检测了卵巢癌线粒体DNA突变，简化了DNA突变的检测过程。项目在卵巢癌突变热点集中的16S、12SrRNA基因、Cytb基因和D-loop区域针对不同类型的线粒体DNA突变设计寡核苷酸探针。我们还意外发现还原石墨烯能够大大增强聚合酶链式反应（PCR）的特异性，经过多轮PCR扩增（最高达到8轮）后仍然可以得到目的产物；还原石墨烯降低了PCR的退火温度，使PCR反应低至25 ˚C时依然能够退火，得到单一的目的产物；对PCR扩增产物进行序列测定，结果显示石墨烯参与的PCR反应产物序列与标准序列没有差异。Zeta电位、紫外-可见光谱及圆二色光谱分析表明石墨烯与DNA聚合酶、DNA模板间的相互作用，以及石墨烯良好的导热性是PCR反应特异性增强的主要原因。用纳米金-寡核苷酸探针可以分辨线粒体DNA的单碱基突变，灵敏度为3.3 nM。该方法虽然简便易行，但灵敏度还不够高。因此我们又用氧化石墨烯-DNA水凝胶构建了一种新型电化学生物传感器，探索了温度、反应体系盐浓度和pH值等因素对传感器的影响。用扫描电镜、原子力显微镜、X射线衍射等方法对氧化石墨烯-DNA水凝胶进行了表征。用探针DNA修饰该电极后，采用电化学阻抗谱(EIS)成功地检测了卵巢癌线粒体DNA的单碱基突变，最低检测限达到1.0 × 10-20 M 。探针DNA与不同浓度（C）互补序列杂交前后的阻抗变化（ΔR）显示ΔR与-logC间具有良好的线性关系。探针序列与单碱基错配序列以及非互补序列杂交前后的阻抗变化值远低于其与互补序列杂交前后的阻抗变化值，证实该电极对DNA突变检测具有良好的选择性。本方法不需要对探针或待测样品进行任何化学或荧光标记，检测灵敏度和准确性大大提高，具有良好的临床应用前景。