腰椎不稳定的微创骨髓基质细胞复合移植稳定重建研究

Lumbar instability is an important reason of low back pain. Although lumbar internal fixation and fusion can effectively stabilize the lumbar spine, the surgical trauma is fairly large, and easily accelerate the the degeneration of adjacent segments. The capacity of well bone formation of bone marrow stromal cells were confirmed by previous research. Therefore, we suggest to apply the mini-invasive injection stabilization by composite graft of bone marrow stromal cells for lumbar instability. Our project is to build lumbar instability model of goat, and the bone marrow stromal cells will be subcultured and induced to bone formation property. The compound tissue engineering cells are injected into the intervertebral space of instable segment of goat by mini-invasive procedure. The bone formation, stabilization of the injection segment and activity of adjacent segments are observed termly, and the mechanism of that is also studied. The general specimen will be collected at last. The stability of injection segment is examined with biomechanics testing device. The comparison will also be performed between experiment group and control group. The activity characteristics of adjacent segments will also be examined with biomechanics testing device.

腰椎不稳定是腰痛产生的重要原因。腰椎固定融合手术虽然可以有效稳定腰椎，但创伤较大，并且易导致相邻节段退变加速。前期工作已证实骨髓基质细胞的良好成骨能力，因此我们提出采用该细胞复合移植物微创注射的方法进行腰椎不稳定节段的稳定重建。我们采用动物实验的方法，建立羊腰椎不稳定模型，将其骨髓基质细胞传代培养，获得成骨活性，制成复合组织工程移植物，应用微创的方法将移植物注射入羊腰椎不稳定节段的椎间隙内，定期观察其稳定重建情况，探讨其机制，并观察相邻节段的活动度。最后取大体标本，用生物力学测试系统观察微创注射节段的稳定性，并与节段内固定和无任何干预组比较。同时用生物力学测试各组之间稳定重建相邻节段的活动特点。

本研究的内容为采用羊自体骨髓基质细胞进行传代培养，并与羟基磷灰石颗粒混合制备复合组织工程移植物。在体外检测并验证传代细胞的成骨活性和椎间盘髓核细胞样活性。在复合组织工程移植物植入羊腰椎不稳定区域后，定期观察目标区域的成骨和椎间盘修复情况，并从实验节段取材，观察移植细胞成骨表型的表达和成骨量的变化，以及椎间盘修复作用，验证稳定重建效果。.截至2014.12.31，本研究已完成部分包括：.1、山羊骨髓间充质干细胞的体外分离.在无菌操作条件下对山羊的髂骨穿刺，抽取山羊骨髓，反复吹打制成单细胞悬液，在胎牛血清和αMEM混合培养液中培养。.2、山羊骨髓间充质干细胞的传代培养.原代培养的山羊骨髓间充质干细胞培养7天后，细胞生长融合达到培养皿底的80-90%时对细胞进行传代培养。随着培养的进行通过多次换液弃去杂质，使细胞的纯度逐渐提高。.3、骨髓间充质干细胞的成骨方向分化.将传代细胞传入24孔培养板内的盖玻片上继续培养，待细胞爬在盖玻片上接近长满时，加入终浓度分别为10-8mol/l地塞米松和10mmol/lβ-磷酸甘油，以及Vit-C继续培养一周。.4、骨髓间充质干细胞的成骨方向分化的观察和检测.原位杂交：取向成骨方向分化培养一周的骨髓基质细胞，行OP、ON和I型胶原基因表达的原位杂交，并行碱性磷酸酶（ALP）染色。.传代培养细胞中可见ON mRNA、OP mRNA和I型胶原mRNA表达（+）。传代细胞ALP染色时，胞浆中出现浅棕黑色颗粒染色阳性。上述结果说明在成骨诱导下的传代细胞显示成骨能力。 .5、具有成骨方向分化能力的骨髓间充质干细胞与载体的混合.将平均直径20μm的羟基磷灰石粉末置于24孔培养板内，经检测具有成骨方向分化能力的骨髓间充质干细胞经过消化，传入培养板内，并与载体粉末相混合，定期观察细胞与载体粉末的结合情况，细胞在载体粉末上的分布，以及细胞的生长情况。