BDNF-TrkB信号囊泡的正向运输促进神经元轴突的发育

Axon formation depends on local accumulation of axon determinants and enhanced activity of signaling pathway, which prompt accelerated growth of axon. BDNF can initiate axon formation by elevating intracellular signal activity through TrkB receptor on the surface. My previous work showed that BDNF can prompt anterograde transport of TrkB and trigger membrane insertion of TrkB, a process amplifying BDNF action. However, the underlying mechanism for BDNF-induced anterograde transport of TrkB receptor in the axon is not clear. Here I will label BDNF endosome by quantum dot (QD) and label TrkB transport vesicles by TrkB-GFP simultaneously. Then track the intracellular transport of TrkB-GFP vesicles colocalized with BDNF endosomes to explore the BDNF binding effect on TrkB transport direction and velocity. To further explore the role of anterograde transport of BDNF-TrkB signaling endosome, I will detect PKA activity induced by BDNF bath application, surface expression of TrkB and axon development after blocking anterograde motor protein using dominant negative KIF5B-GFP. Above study will establish a state-to-art method to label BDNF-TrkB signaling endosomes and provide new insight into axon development.

神经元轴突的发育依赖信号分子在局部形成累积，引起信号通路活动的增强，造成轴突的迅速生长。BDNF可以通过TrkB受体激活胞内的信号通路，启动轴突的发生。申请人以前的工作发现BDNF可以促进TrkB受体在轴突正向运输和在膜上的表达，放大了自身的信号效应，造成胞内信号分子的局部累积。然而BDNF引起TrkB受体正向运输的机制尚不清楚。为了明确这一机制，申请人计划用量子点标记单个的BDNF内吞囊泡，同时用TrkB-GFP标记TrkB受体的运输囊泡，观察二者共定位的囊泡在轴突内的运输特性，以明确BDNF结合TrkB后对TrkB运输的影响。通过突变正向马达分子，明确BDNF-TrkB信号囊泡的正向运输对BDNF诱导的PKA信号活性，TrkB受体在膜上的表达量以及轴突发育造成的影响。以上研究建立了BDNF-TrkB信号囊泡的新型标记技术，并为轴突发育提供了新颖的机制。

1. 应用stripe assay研究CXCL12介导的神经前体细胞的迁移和极化. 在胚胎的脑发育过程中，神经前体细胞的极化和迁移过程至关重要，大量研究表明，趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在此过程中扮演了重要角色。传统的研究细胞迁移的方法只能看出细胞的整体迁移趋势，不便研究单个细胞迁移的动态过程以及迁移过程中细胞骨架重构的细节变化。我们利用stripe assay,不仅明确了CXCL12对神经前体细胞的趋化作用，并且我们改进了stripe assay，在CXCL12条带形成的浓度梯度下，用免疫组化技术看到了CXCR4，信号分子Rac和细胞骨架蛋白actin的再分布，并且实时观察了信号分子和细胞骨架蛋白再分布的动态过程。..2. 应用stripe assay研究神经前体细胞的迁移机制. 神经前体细胞的迁移对脑发育，神经元形成，脑损伤后神经元再生等过程都至关重要。趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在此过程中的重要作用已经被广泛研究，然而，一种最新发现的CXCL12受体CXCR7在这一过程中的作用尚不清楚。CXCR4或者CXCR7的拮抗剂均能阻止CXCL12介导的神经前体细胞迁移。利用stripe assay和transwell assay，我们发现CXCR4基因敲除小鼠的神经前体细胞，仍然会趋向于CXCL12迁移，提示CXCR7可以独立介导迁移的过程。在体实验表明，向成年鼠脑内移植CXCR4基因敲除小鼠的神经前体细胞，移植细胞会沿着CXCL12浓度梯度迁移，CXCR7的拮抗剂可以阻断这一过程。分子机制研究进一步表明，CXCR7和Rac1参与ERK信号通路，引发神经前体细胞的迁移，该信号通路独立于CXCR4介导的信号通路。以上结果揭示CXCR7在CXCL12介导的神经前体细胞迁移中有重要作用。