万寿菊花器官同源异型突变的转录组分析及相关基因功能研究

TThe efficiency of cross-breeding was limited because of the labor costing procedures of emasculation of capitulum in the composite family. So, male sterile plants will greatly promote the breeding process of new varieties. In this project, taking the marigold male sterile two-type line M525AB, resulted from spontaneous floral organ homeotic conversion, as experiment material, the transcriptome sequencing (RNA-seq) and Digital Gene Expression Profiling (DGE) will be conducted to isolate difference ESTs related to the flower organ homeotic conversion. The candidate genes will be obtained through bioinformatics analysis and the semi-quantitative RT-PCR technology, and the full-length of the candidate genes will be acquired by the RACE method. Finally, the spatial and temporal expression pattern and gene function analysis of candidate genes will be carried out by Realtime-PCR, RNA in situ hybridization and genetic transformation during the inflorescence development process of sterile and fertile marigold. The implementation of the project could not only identifies the genes related to flower organ homeotic conversion in male sterile marigold, but also helps to reveal the molecular mechanism of homeotic conversion and to create the new male sterile plants.

菊科植物的头状花序造成了育种过程中的去雄障碍，从而限制了杂交育种的有效开展。雄性不育材料的获得将大大推进菊科植物新品种的培育进程。本课题旨在以花器官发生同源异型突变的万寿菊雄性不育两用系M525AB的花蕾为材料，进行转录组测序（RNA-seq）和表达谱测序（DGE），分离出与万寿菊花器官同源异型突变相关的差异ESTs，通过生物信息学分析和半定量RT-PCR技术，找到导致花器官同源异型突变的候选基因，结合RACE等方法获取候选基因的全长，利用realtime-PCR、RNA原位杂交技术和转基因技术完成候选基因在不育和可育万寿菊花序发育过程中的时空表达分析和功能验证。项目的实施不仅可以发掘与不育万寿菊花器官同源异型突变相关的基因，而且有助于揭示导致花器官同源异型突变的分子机理，为植物不育材料的创制提供借鉴。

万寿菊复杂的头状花序，使得人工去雄过程困难，阻碍了育种进程。万寿菊雄性不育分子机理尚不清晰。以万寿菊不育株和可育株1mm和4mm的花蕾为材料，建立了一个万寿菊花蕾发育时期的参考转录组和11个数字基因表达谱文库，共获得 90,547,072条raw reads， 87,473,431条clean reads和65,857条Unigenes，其中34176（51.89%）个unigenes的基因功能得到注释。1mm可育和不育花蕾之间共有557个差异基因，仅有一个MADS-box家族基因的表达水平具有显著的差异；4mm可育和不育花蕾之间共有785个差异基因，有12个MADS-box家族基因的表达水平存在显著的差异。克隆五个B类基因，比较基因序列，仅不育株中TePI基因的gDNA插入一个约1100bp的片段，并导致cDNA序列多出12个碱基，命名为TePI-2。采用qRT-PCR研究万寿菊B类基因在不同组织器官和不同花蕾发育时期的表达情况，研究结果发现，所有的B类基因在不育株雄蕊中的表达量都比可育株雄蕊中的表达量低，在不育花蕾中的表达量也比同时期可育花蕾中的表达量低。蛋白互作实验表明，TePI-1和TePI-2均能与DEF/AP3类四个蛋白质发生互作，但是突变的TePI-2蛋白质与DEF/AP3类四个蛋白质的互作强度要明显减弱。超量表达载体35S:: TePI-1转化后的烟草植株变小，花器官缩小，雌蕊明显短化，超量表达35S::TePI-2的转基因烟草花器官没有发现明显的表型变化。TePI突变一方面影响自身和其他基因的表达，另一方面影响蛋白质的互作，从而导致花器官的同源异型突变。该研究结果解析了万寿菊雄性不育产生的分子机理，有助于揭示导致花器官同源异型突变的分子机理，为植物不育材料的创制提供借鉴。