从血管内皮细胞生长因子分子表达探讨益气清热解毒法重建肾小球滤过屏障的研究

蛋白尿是慢性肾炎进展的核心因素。肾小球滤过屏障（内皮细胞、GBM和足细胞）功能障碍是形成蛋白尿的主要原因。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种促进血管生成的因子，VEGF通过自分泌的方式作用于足细胞（通过VEGFR1），同时多数VEGF蛋白穿过肾小球基底膜（GBM）作用于内皮细胞（通过VEGFR1和VEGFR2），从而导致肾小球滤过屏障损伤。肺气亏虚、卫表不固、热毒内扰、肾失封藏是慢性肾炎发生蛋白尿的重要中医病机。本研究采用嘌呤霉素氨基核苷（PAN）单次颈静脉注射法建立PAN肾病模型，实验大鼠分为正常对照组、模型组、蒙诺组及益气清热膏大、中、小剂量组，于1、3、5、10、14、21天分别收集血、尿及肾组织标本。从VEGF等的分子表达变化观察益气清热解毒法对肾小球滤过屏障的影响，探讨慢性肾炎（气虚外感热毒证）的中医病机理论及药物干预效应的分子基础，丰富中医"肾主藏精、封藏失职"的理论内涵。

本研究先从理论层面论证慢性肾炎从肺论治的科学性。在实验方面，通过动态观察氨基核苷嘌呤霉素（PAN）大鼠模型的蛋白尿、肾脏病理及滤过膜屏障相关分子的变化趋势，发现：益气清热膏可降低PAN大鼠第9天、14天尿蛋白（P<0.01）。该作用与蒙诺相当。益气清热膏可显著升高大鼠总蛋白（TP）和白蛋白（Alb）（P<0.05）；降低总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平（P<0.05），该作用与蒙诺相当。病理：模型组术后第10天出现系膜细胞及基质增生，球囊粘连，小管上皮空泡变性，蛋白管型，间质炎性细胞浸润，第15天加重。电镜发现第3天出现肾小球足突融合，线粒体肿胀。上述改变于术后第10天加重，第15天自发缓解。益气清热膏可显著减轻上述病理改变，与蒙诺相当。免疫组化显示，Nephrin在术后第3天表达下降，第15天最低，益气清热膏和蒙诺均可提高nephrin表达。分子生物学检测显示：podocin和CD2AP的表达在术后各个时间点均明显下降，益气清热膏和蒙诺均可显著升高podocin和CD2AP表达（P<0.01）。RT-PCR及半定量分析结果显示，nephrin、podocin和CD2AP 的mRNA水平在术后各时间点均升高，益气清热膏和蒙诺可以显著降低上述分子的mRNA水平（P<0.01）。模型组总VEGF-A的蛋白及mRNA表达在造模后第三天开始明显升高，随着时间延长，VEGF-A表达逐渐增加，益气清热膏和蒙诺均可以降低VEGF-A的蛋白及mRNA表达（P<0.05）。对VEGF-A受体的研究，我们通过RT-PCR检测发现：模型组VEGFR1在造模后第三天即可见明显的表达升高，在第十天达到高峰，第15天呈下降趋势；VEGFR2在造模后第三天即可见显著升高，之后逐渐升高。益气清热膏可以显著降低VEGFR1和R2表达(P<0.05)。综上：益气清热膏可降低PAN 大鼠尿蛋白水平，提高血清白蛋白，改善血脂代谢，修复足细胞损伤。其机制可能是抑制VEGF高表达，从而上调肾组织中nephrin、podocin及CD2AP蛋白表达，反馈性抑制其mRNA水平，维持足细胞裂孔隔膜完整性相关。该研究揭示了益气清热膏治疗蛋白尿的作用机制，阐释了“慢性肾炎从肺论治”的科学内涵，为临床治疗蛋白尿提供了新的治疗思路。发表核心期刊论文8篇，培养硕士研究生5名，博士研究生1名。