基因工程化的溶瘤病毒治疗人脑胶质瘤干细胞巢的研究

研究抑制血管生成的融合基因（Endo-Angio）修饰的溶瘤病毒治疗人脑胶质瘤干细胞巢的疗效。通过人脑胶质瘤标本培养脑胶质瘤干细胞并利用其相关标记物CD133、Nestin 及GFAP免疫荧光进行鉴定后，流式细胞仪筛选CD133+肿瘤干细胞并进行细胞培养。研究基因工程化的溶瘤病毒对其作用；并采用RT-PCR及Western blot检测Endo-Angio融合基因及蛋白表达；建立裸鼠人脑胶质瘤干细胞动物模型，研究其与体外培养的肿瘤干细胞生物学特征的变化；并利用基因工程化的溶瘤病毒裸鼠脑内注射观察肿瘤大小及组织病理变化、荷瘤鼠的生存时间及采用CD133-PE和CD31-FITC直接免疫荧光双染观察肿瘤干细胞巢内肿瘤干细胞及微血管构筑在治疗前后的变化，并与原脑胶质瘤组织标本对比。从而确定Endo-Angio工程化的溶瘤病毒对脑胶质瘤干细胞及血管巢的作用，为探索脑胶质瘤新的治疗靶点提供依据。

本项目旨在研究抑制血管生成的内皮抑素和血管生成抑素（Endo-Angio）融合基因修饰的溶瘤病毒（VAE）对胶质瘤干细胞（GSCs）来源的肿瘤的治疗作用。方法：1）体外实验：新鲜高级别（WHO分类Ⅲ、Ⅵ级）人脑胶质瘤标本经原代培养获得GSCs，免疫荧光技术检测未分化GSCs的CD133、Nestin及分化后GFAP、NF和MAG的表达；流式细胞术检测原代培养的GSCs中CD133阳性细胞数；单克隆形成实验检测GSCs的自我更新能力；MTS法检测VAE对GSCs增殖活性的影响，RT-PCR和Western blot检测Endo-Angio融合蛋白的表达及融合蛋白对人脑微血管内皮细胞（HBMEC）增殖的影响；观察VAE处理后仍存活细胞的自我更新和诱导贴壁情况；2）体内实验：裸小鼠颅内原位GSCs移植瘤及皮下移植瘤模型的构建；MRI观察VAE对GSCs荷瘤裸小鼠肿瘤体积的影响，RT - PCR和Western blot检测Endo-Angio融合蛋白的表达并行免疫组化CD31染色检测其对微血管密度(microvessel density, MVD)的影响；最后观察病毒处理后荷瘤裸小鼠的生存情况。结果： 1）从高级别胶质瘤标本中培养出的GSCs，能够表达CD133及Nestin，并具有自我更新能力和多向分化能力； 2）VAE能够感染GSCs并对GSCs增殖活性有明显抑制作用(P＜0.05)； 3）VAE感染GSCs 48h后，基因水平及蛋白水平都有Endo-Angio融合蛋白表达，该融合蛋白使HBMEC增殖活性明显下降(P＜0.05)；4）VAE感染后仍存活的细胞不再具有形成GSCs球的能力，加入血清诱导后也不再贴壁生长；5）VAE感染GSCs 荷瘤裸小鼠10天后，基因水平及蛋白水平都有Endo-Angio融合蛋白表达，该融合蛋白使肿瘤微血管密度明显降低(P＜0.05)；6）MRI检查发现VAE感染GSCs荷瘤裸小鼠后，颅内肿瘤体积明显减小；7）VAE感染后GSCs荷瘤裸小鼠生存时间明显延长(P＜0.05)。结论：在体外，VAE能够显著抑制GSCs活性，能够表达具有生物活性的Endo-Angio融合蛋白；体内，VAE能感染GSCs来源的裸鼠脑胶质瘤并能表达具有生物活性的Endo-Angio融合蛋白，杀伤GSCs的同时抑制肿瘤血管生成，为脑胶质瘤病毒-基因治疗开辟了新的途径。