大豆疫霉菌胁迫下大豆素合成途径相关酶基因的克隆及功能验证

大豆素是大豆受疫霉菌诱导后形成的与抗性紧密相关的重要植保素，关于其合成途径关键酶基因的克隆及功能研究在我国尚属空白，鉴于大豆疫霉根腐病在我国逐年危害严重的现状以及大豆疫霉菌致病分化复杂、品种抗性易于丧失的特点，本研究通过克隆大豆素合成途径中的重要酶- - 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、香豆酸辅酶A连接酶(4CL)和异黄酮还原酶（IFR）基因，构建相关RNAi载体，通过农杆菌转化大豆，验证基因片段的RNAi对靶酶表达的调控作用；研究基因在大豆中的时空差异和协调表达；并将克隆的基因分别进行大豆遗传转化。可为进一步解析植保素的生物合成途径提供依据，也将对持久抗病基因工程的实现具有一定的推动作用。同时对保护我国自主知识产权的大豆基因资源具有重要的意义，进而加速和缩短我国大豆疫霉根腐病的抗病育种进程，尽早解决该病对生产的危害问题。

由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的大豆疫霉根腐病是严重影响我国大豆生产的毁灭性病害，大豆素（glyceollin）是受大豆疫霉菌侵染后在大豆中产生一类重要的大豆植保素，大豆素的累积与大豆对疫霉根腐病的抗性紧密相关，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、香豆酸辅酶A连接酶(4CL)和异黄酮还原酶（IFR）是大豆素合成途径的关键酶基因。在国家自然科学基金的资助下，本课题克隆到了PAL、4CL、IFR基因的全长，并对其序列进行了生物信息学分析。用Real time PCR进行了基因的表达模式分析，发现PAL、4CL基因受疫霉菌、冷、暗、紫外、SA、ABA诱导表达，且4CL基因随着时间变化受ABA诱导表达增强，和ABA密切相关。PAL、4CL、IFR基因进行了烟草和大豆的遗传转化工作，抗病性鉴定表明，转基因植株均提高了对烟草疫霉菌和大豆疫霉菌的抗性，且转基因大豆植株中木质素的含量增加，PAL酶活性增强。转基因植株大豆素含量明显高于对照，300µg大豆素对大豆疫霉根腐病菌的菌丝生长有明显的抑制作用，600µg大豆素可以抑制疫霉菌游动孢子的形成以及释放。将PAL、4CL、IFR基因构建到RNAi载体，进行了大豆的遗传转化，RNAi后PAL基因大豆植株较对照感病严重，其次是RNAi后转4CL基因的大豆植株，而转IFR基因大豆植株的抗病性变化不明显，这有可能是PAL是大豆素途径第一个关键酶的原因。