南极微球菌低温beta-葡糖苷酶的特性与冷适应机制及其基因研究

以具有自主知识产权的南极微球菌为出发材料，该菌株可降解多种有机污染物，含有多种典型的低温酶，如低温beta-葡萄糖苷酶。本申请项目拟在提取纯化该菌株的低温beta-葡萄糖苷酶，研究其特性以及催化动力学特性；通过构建基因文库的方法克隆该菌株的低温beta-葡萄糖苷酶的基因并在大肠杆菌中表达，获得低温beta-葡萄糖苷酶高产重组菌株；通过分析该酶的氨基酸组成与特点，以及采用定点突变的方法研究酶蛋白一级结构、高级结构（构像）变化对酶的催化活性与热稳定性的影响，阐述其冷适应机制。对于丰富低温beta-葡萄糖苷酶的研究以及该酶的冷适应机制的阐述都具有重要意义；同时也可以为南极微球菌在低温污水处理中的应用奠定理论基础；获得的高产重组菌株，为低温beta-葡萄糖苷酶的生产及其在冷洗行业、食品添加剂、污染环境的生物修复、生物转化（如转化生物质生产清洁的乙醇燃料）和分子生物学研究等方面的应用奠定良好基础。

葡萄糖苷酶可以降解短链的寡糖（2-6单糖聚合物），近年来beta葡萄糖苷酶在木薯解毒，果汁脱苦等食品加工过程得到广泛商业应用。低温葡萄糖苷酶在低温水处理、冷洗行业等有极其重要的作用。尤其是低温食品加工行业低温beta葡萄糖苷酶可防止食品酸败及营养剂风味遭到高温破坏。.本课题从南极微球菌Micrococcus antarcticus的基因文库中克隆了首个嗜冷葡萄糖苷酶—BglU。序列分析显示bglU全长1419bp，编码472氨基酸。序列比对显示BglU属于GH1家族。重组6His-BglU呈现明显的温度不稳定性：30 oC的Tm1/2仅30分钟。BglU的最适酶反应温度为25 oC、 最适酶反应pH为 6.5。BglU的最适低物为纤维二糖和p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG).最适条件下，以 pNPG做底物, Km 和 kcat 分别为 7 mmol/L和7.85×103/s. .本课题同时解析了BglU蛋白结构，从蛋白结构上（特殊氨基酸及二级结构的使用）解释其冷适应机理。低温条件下(4 oC)，本课题成功获得BglU的晶体，并在2.2 Å的分辨率下解析了该蛋白结构。和其他来自GH1家族的同源蛋白类似，BglU结构为典型的TIM barrel折叠。一个大而深的底物结合口袋位于BglU的表面，其中深约20 Å 体积约 1858 Å3。通过序列及结构比对，His299在其他蛋白中是高度保守的Try，突变子H299Y的酶活、最适反应温度及温度稳定性都明显增加；这说明His299是该蛋白高低温活性，低最适反应温度和温度敏感主要原因。突变子G261R 和Q448P与野生酶BglU相比，增加了最适反应温度，但是低温酶活却有所减少最大酶活没有变化。突变子A368P, T383P, 和 A389E的最适反应温度，温度稳定性及低温酶活均小幅增加。突变子K163P, N228P, 和 H301A 的酶活显著减少。综上，His299在酶反应中负责传递质子，是嗜低温酶BglU冷适应的主要原因。脯氨酸，精氨酸和谷氨酸的低含量是其冷适应的另外一个原因。这些研究结果有助于基于结构信息的低温酶分子改造，为设计适合各种不同温度工业过的低温酶程提供了结构基础。