甘油阻遏调控缺失的醇氧化酶1启动子突变体和毕赤酵母突变株的构建，鉴定及应用

巴斯德毕赤酵母已成为一个成功的外源蛋白表达系统。但是现有的以甲醇为唯一碳源和能源的发酵工艺存在菌体死亡率高，生长速度慢，产热量和耗氧量大等缺陷。借鉴大肠杆菌Lac启动子的成功改造经验，我们提出了甘油阻遏调控缺失的AOX1启动子突变体和毕赤酵母突变株的改造策略，并利用Invitrogen公司最新推出的PichiaPink菌株建立了研究AOX1启动子阻遏调控机制的高通量筛选模型。本研究将利用该模型从顺式作用元件和转录因子两个方面对AOX1启动子的甘油阻遏调控机制进行系统的研究。在确定AOX1启动子甘油阻遏调控相关的顺式作用元件和转录因子，阐明AOX1启动子阻遏调控的分子机制的基础上，本研究还将构建甘油阻遏调控缺失的AOX1启动子突变体和毕赤酵母突变株，并为其建立起比现有发酵工艺更简单高效的混合补料培养或以甘油作为碳源和能源，甲醇作为安慰诱导剂的新型毕赤酵母发酵工艺。

巴斯德毕赤酵母已经成为一个被广泛使用的外源蛋白表达系统。然而，传统的以甲醇作为唯一碳源和诱导剂的高密度发酵工艺存在耗氧高，产热大以及菌体死亡率高等缺陷。由于葡萄糖和甘油等碳源对醇氧化酶1（AOX1）启动子存在强烈的抑制作用，现有的混合补料发酵工艺存在控制过程复杂，结果不确定等缺陷。葡萄糖阻遏缺陷的毕赤酵母宿主菌可以在存在一定浓度的葡萄糖的培养条件下启动AOX1启动子的表达，因此可以简化混合补料发酵工艺的过程控制，并使其结果更加稳定可靠。我们建立了基于营养缺陷筛选标记作为报告蛋白的生长能力筛选系统（筛选通量>109）和基于红色荧光蛋白作为报告蛋白的菌体颜色筛选系统（筛选通量>104）。利用以上筛选系统，我们获得了多株能够在存在一定浓度的葡萄糖的培养条件下启动AOX1启动子的表达的葡萄糖阻遏缺陷的毕赤酵母宿主菌。从基础研究角度，我们利用限制酶介导的随机整合技术鉴定了发生突变的基因；从应用研究角度，我们利用获得的新型宿主菌进行了多个可解离的人血清白蛋白和蛋白药物融合蛋白进行了规模化制备。上述研究结果已经发表在Journal of Controlled Release和Molecular Pharmaceutics等杂志。