TRPC和ORAI1协同构成钙池操纵的钙通道(SOC)的研究

跨胞膜的Ca2+内流引起的胞浆中Ca2+水平上升, Ca2+内流紊乱，导致细胞病理过程的发生。非兴奋细胞的Ca2+内流主要由两类通道实现：（1）钙池操纵的Ca2+通道（SOC）；（2）受体门控阳离子通道(ROC)。但SOC的分子组成一直未明，TRPC是否参与构成SOC亦颇具争议。目前认为STIM1是钙池感应器，Orai1构成SOC的孔隙，钙池释放引起STIM1变构和位移，激活胞膜上的Orai1而产生Ca2+内流。近年来申请者探索了TRPC和Orai1共同构成SOC的可能性，发现TRPC和Orai1可协同构成SOC，并提出了SOC异源构成假说。本课题拟采用双分子荧光互补BiFC和BiFC-FRET、电生理及shRNA等技术，在活细胞中确证SOC 的Orai1/TRPC异源模式假说。这对全面解析SOC的分子构成，阐明SOC的调节机制将提供有力证据，并有助于筛选SOC功能紊乱所致疾病治疗新靶点。

SOC的分子组成一直未明，TRPC是否参与构成SOC颇具争议。本项目一方面围绕SOC异源构成假说，探索了TRPC参与构成SOC 的可能性；采用钙影像、双分子荧光互补BiFC、免疫共沉淀等技术方法表明TRPC3/6/7及TRPC1/4/5的VN155/VC155形式并没有改变其野生型构成Ca2+通道的功能，且其N-末端对于通透Ca2+是必须的；TRPC1/4/5/3/6/7均能形成同源聚合体，任两者之间均能形成异源聚合体，且它们相互结合的功能结构域位于N-末端。另一方面根据XW.Hou关于Orai1蛋白晶体结构的最新报道，在PC12细胞以及大鼠皮质神经元中，采用慢病毒感染沉默Orai1,对Orai1的功能进行深入步研究。结果表明，在沉默Orai1的PC12细胞中，细胞的分化受到明显的抑制，并且该分化信号途径能够被PKC的抑制剂GF109203X正反馈调节；同时在大鼠大脑皮质原代培养的神经元中，沉默Orai1引起神经元树突棘缺失，而且明显降低神经元轴突对神经营养因子的趋化性。