LncRNA GCAT1介导miR-155-5p/PTEN/PI3K/Akt通路调控腺性膀胱炎进展的作用机制研究

Glandular cystitis, a disease with increasing incidence and recurrence rate, has the potential of malignant progression, but its pathogenesis remains unclear. Through microarray screening and bioinformatics analysis, we found that the expression of lncRNA GCAT1 in glandular cystitis tissues was lower than in normal bladder tissues. It has the same base sequence as PTEN and the sequence is complementary to miR-155-5p. Pathway analysis suggested that PTEN may be involved in the regulation of PI3K/Akt signaling axis. Our preliminary experiments confirmed that GCAT1 was low expressed in glandular cystitis, and the expression level was negatively correlated with miR-155-5p, and positively correlated with PTEN. Based on above, we hypothesize that GCAT1 regulates PTEN/PI3K/Akt signaling pathway by competitively binding miR-155-5p through ceRNA mechanism, thereby affecting the development of glandular cystitis. This project intends to verify this hypothesis by in vivo, in vitro and clinicopathological methods through dual luciferase reporter, RIP and in situ hybridization, in order to clarify the epigenetic mechanism with ceRNA regulatory network and provide a new biomarker and therapeutic target for the diagnosis and treatment of glandular cystitis.

腺性膀胱炎发病率有上升趋势，易复发、有恶性进展潜能，目前其调控机制尚不明确。申请人前期通过基因芯片、生物信息学技术分析发现lncRNA GCAT1在腺性膀胱炎组织中表达下调，与PTEN有一段相同的能和miR-155-5p互补结合的碱基序列，而pathway分析提示PTEN可能参与调控PI3K/Akt信号轴。随后细胞实验证实，GCAT1在腺性膀胱炎细胞中低表达，且表达水平与miR-155-5p呈负相关，与PTEN呈正相关。据此我们提出假设：GCAT1通过ceRNA机制竞争性结合miR-155-5p，调控PTEN/PI3K/Akt信号通路，从而影响腺性膀胱炎的进展。本项目拟通过双荧光素酶报告基因、RIP和原位杂交等方法，从体内、体外和临床病理等角度来验证这一设想，以阐明上述调控网络为核心的腺性膀胱炎进展机制，为其诊治提供新的靶点。

腺性膀胱炎（Glandular Cystitis，GC）是一种易复发的膀胱炎症性疾病，病理表现为移行上皮的增生与化生。GC的症状主要以尿路刺激症以及血尿为主，严重影响患者的生活质量与身心健康。GC曾经被认为发病率较低，但随着膀胱镜的普及，病理活检的增加，GC的检出率不断升高，影响范围不断扩大。GC与膀胱癌并没有明确的因果关系，但是部分GC可能存在癌变的倾向。GC具有较高的术后复发率，尚无有效的治疗方法，且无法预测哪一类型更易复发。长链非编码RNA（Long noncoding RNA ，LncRNA）是一种小于 200 nt 且不编码蛋白质的 RNA，具有多种生物学功能。在我们研究中发现了一种新的LncRNA GCAT1可能参与GC的发生与发展。本项目按年度计划进行，首先利用纳入的278位患者，我们开发并验证了列线图来预测 CG 复发的个体化风险。此外，我们还证明，在随访期间，肠道 CG 和典型 CG 都不会增加随后患膀胱癌的风险。并且利用190例患者进行回顾性研究，使用单因素与多因素logistic回归分析探究GC复发的危险因素。对3例GC患者与3例正常对照进行测序筛选出差异表达的基因。使用KEGG和GO分析了差异表达基因，同时确认了GCAT1作为目标基因。对10例患者进行验证测序；获得差异表达的lncRNA后，选取ENST00000561746（lnc GCAT1）进行机制探究。采用qPCR检测GC组织与正常组织的GCAT1表达。使用收集到的GC手术标本，分离培养GC原代细胞。使用质粒构建GCAT1过表达与敲减的细胞模型。使用CCK-8试剂盒检测细胞模型的细胞活力与增殖能力，用Transwell小室检测细胞的侵袭能力。ELISA法检测TNF-α和IL-1β的分泌表达量。使用生物信息学方法预测GCAT1的靶向miRNA与下游基因。采用qPCR法检测GC组织与正常组织的PTEN与miR-155-5p的表达。使用qRT-PCR和Western blot方法检测miR-155-5p与PTEN在正常人与GC患者病理组织的差异与原代GC细胞模型中的表达。CCK-8试剂盒和Transwell小室被用来检测细胞活性与增殖能力。ELISA法检测TNF-α和IL-1β的分泌表达量。使用双荧光素酶实验验证miR-155-5p与GCAT1和PTEN的结合位点。