运用激光捕获显微技术鉴定参与拟南芥种子表皮细胞果胶质形成的关键基因

拟南芥种子表皮细胞在分化过程中大量积累果胶类多糖，该过程被认为是研究果胶质生物合成机制的一种理想的模式体系。激光捕获显微分离系统(LCM)技术的最大优点在于能快速准确地从复杂组织中分离出细胞亚群，甚至单个细胞。因此，本项目将结合LCM和基因芯片技术,并以拟南芥种子表皮细胞为实验材料,系统地研究在拟南芥种子表皮细胞粘液形成过程中参与果胶质生物合成及其调控的关键途径。旨在完整地绘制参与粘液果胶质生物合成相关基因的转录图谱，评估各基因家族在果胶质形成网络中的贡献，确定在该网络中具有主效性的基因或基因群，进而功能鉴定参与果胶质生物合成及其调控的关键基因，目标是为解析果胶质的生物合成及其调控机制提供直接的依据和数据库，为阐明果胶质的生物学功能具有重要意义以及为通过基因工程改良果胶质来获得可高效转化的纤维生物质原料奠定基础。

果胶质是植物初生细胞壁的重要组分，在植物生长发育、形态建成和防御反应等过程中都发挥着重要作用。最近研究表明，降低纤维生物质中果胶质同型半乳糖醛酸（HGA）含量可以显著提高纤维生物质的转化效率，可显著降低燃料乙醇生产中对酸预处理的需求（Lionetti等，2010，PNAS）。拟南芥种子表皮细胞在分化过程中大量合成果胶质多糖，被认为是研究果胶质生物合成机制的一种理想的模式体系。利用激光捕获显微分离（LCM）技术能快速准确地从复杂组织中分离出细胞亚群，甚至单个细胞，是对特定发育时期的细胞进行研究的有效手段。本项目结合LCM和基因芯片技术，以拟南芥种子表皮细胞为实验材料，系统地研究在拟南芥种子表皮细胞粘液质形成过程中参与果胶质生物合成及其调控的关键基因。通过基因芯片分析发现，授粉后第7天的种皮（7 DPA，此期果胶质大量合成）相比4 DPA（果胶质尚未合成），分别有462个基因和394个基因上调和下调（2倍以上）。据此挑选了116个差异表达基因，订购了150个T-DNA插入突变体，筛选到4个果胶质结构发生改变的突变体（mud7、mud14和mud93），分别编码阴离子通道蛋白（mud52）、纤维素合成酶类似基因CSLA2（mud93）和两个参与木聚糖合成的糖基转移酶基因（mud7和mud14），mud93果胶质层明显变薄，mud7、mud14和mud52的果胶质层非常容易脱落，通过一系列生化和分子生物学实验对其基因功能进行了详尽的分析，发现CSLA2编码一个甘露聚糖合酶，突变体中甘露糖缺失，导致果胶质层结构变得致密，而果胶质的单糖组成未发生改变。mud7和mud14中木糖含量缺失，导致水溶性果胶含量提高，非常容易脱落，表明半纤维素（甘露糖和木糖）在果胶质的结构维持中起着重要的作用，其可能通过与纤维素交联在一起共同维持果胶质的固有形态。mud52 编码一个阴离子通道蛋白，突变体中钙离子浓度降低，果胶甲酯化程度降低，影响了HG与钙离子交联的形成。这些结果的获得进一步丰富对果胶质多糖结构及其连接方式的认识，并将为今后通过基因工程调控果胶质的组成来获得可高效转化的纤维生物质原料奠定基础。. 我们按照原计划开展了研究工作，取得了预期的研究成果。已在国内外学术期刊发表论文4篇，其中SCI收录3篇，培养青年科研骨干4名，其中2名已由助研晋升为副研，培养了2名博士研究生和2名硕士研究生。