mtCB1通过PINK1/PARKIN调节线粒体自噬参与电针脑保护作用的研究

Involved in cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury, mitochondria is an exciting target of clinically translatable therapeutics. Appropriate regulation of mitochondrial autophagy(mitophagy) would inhibit the onset of apoptosis, attenuate the cellular I/R injury. And the recent published research showed that type-1 cannabinoid receptor (CB1) is present at the membranes of mouse neuronal mitochondria (mtCB1), where it directly controls cellular respiration, energy production, calcium homeostasis and apoptosis. Meanwhile, the upregulation of endocanabinoids system (ECS) is one of the central mechanisms of neuroprotective effect induced by elctroacupuncture(EA). Our preliminary experiments shown that EA could regulate mitochondrial function, merely activation of mtCB1 could significantly increase the activity of neurons with oxygen-glucose deprivation injury, and up-regulate the expression of PINK1 which is a crucial factor associated with selective mitophagy. Therefore, we speculate that mtCB1 is essential for neuroprotective effect induced by EA, activation of mtCB1 will regulate mitophagy through PINK/PARKIN pathway, and finally result in inhibition of mitochondrial dysfunction and neuroprotective effect. Mitochondrial CB1 knockout mice, immunoelectron microscopy, and siRNA techniques will be used in this study to investigate the regulating effect of mitophagy induced by EA through mtCB1, to confirm the molecular mechanisms that mtCB1 regulates mitophagy through PINK1/PARKIN to attenuate ischemia reperfusion injury. The present study is aimed to represent a promising therapeutic target for treatment of stroke, and provide novel evidence and insights on the neuroprotective effect induced by EA.

线粒体参与脑缺血损伤的多个环节，是临床中风治疗的新希望。适度的线粒体自噬可防止凋亡触发，减轻细胞损伤。最新研究发现线粒体上存在大麻素受体mtCB1，调节其呼吸和能量代谢、钙稳态及细胞凋亡。而我们发现内源性大麻素系统是电针脑保护作用的关键机制之一；进一步预实验显示：电针可调节线粒体功能，激活mtCB1不仅有脑和线粒体保护作用，还上调线粒体自噬相关蛋白PINK1表达，提示电针可能通过mtCB1作用PINK1/PARKIN通路，促进损伤线粒体自噬，调节线粒体功能，从而减轻脑缺血性损伤。本项目拟以mtCB1为靶点，应用基因敲除小鼠、免疫电镜、RNA干扰等技术，研究电针通过mtCB1调节中风后损伤线粒体自噬的作用，探索电针通过mtCB1作用于 PINK1/ PARKIN通路调控线粒体自噬，发挥脑保护作用的分子机制，从而为中风后线粒体功能调节提供新的治疗靶点，为针刺治疗缺血性脑中风提供新的理论依据。

线粒体功能障碍是脑缺血再灌注（I/R）所致神经元损伤的重要环节之一，改善线粒体功能有望成为临床中风治疗的新靶点，然而目前临床缺乏相应安全有效的干预药物或措施。最新研究发现，线粒体上存在1型大麻素受体mtCB1，可以直接调控线粒体呼吸和能量代谢、钙稳态等，并参与调节记忆等高级脑功能。在本研究中，我们以mtCB1为切入点，应用分子生物学、免疫电镜等技术，深入探索了电针对线粒体功能的调控作用，并取得了以下发现：电针预处理可显著改善全脑I/R后神经功能评分，应用可透过或不可透过细胞膜的CB1受体选择性拮抗剂，可以实现对细胞内或单纯细胞膜上CB1受体的阻断，而电针的神经保护作用主要是通过mtCB1介导的；mtCB1在全脑I/R后2小时表达显著增高，至24小时逐渐降至I/R前水平；我们前期研究证实电针的主要神经保护作用是通过内源性大麻素ACEA来实现的，因此在后续研究中，我们主要应用了ACEA模拟电针的作用，发现ACEA同样可以显著增加mtCB1表达，选择性阻断细胞膜上的CB1后，并不能逆转ACEA对mtCB1的调节作用；选择性激活mtCB1后，可以显著改善I/R后24、48、72h的神经行为学评分，抑制caspase-3介导的凋亡通路，减少海马区神经元凋亡，并改善离体氧糖剥夺（OGD）后的神经元活性。mtCB1介导的I/R后的神经保护机制可能主要包括两个方面：1）显著改善全脑I/R后海马区的线粒体功能，包括保护线粒体超微结构，抑制氧化应激，减少线粒体膜通道转化孔的开放，增加线粒体膜电位，并改善线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ的活性等；2）促进局灶I/R后半暗带内线粒体的生物发生，其作用可能是通过促进GSK-3ß磷酸化，调控相应的信号通路实现的。上述研究不仅为针刺治疗缺血性脑中风提供新的理论依据，更为中风后线粒体功能调节提供新的治疗靶点，丰富了内源性大麻素系统对神经功能调节作用的理论内涵。