利用3D生物打印技术构建血管化组织工程膀胱补片的研究

The problem of vascularization of tissue engineered bladder grafts is the main technical barrier that hinders the clinical application of this technology. 3D bio-printing technology is expected to solve the problem of vascularization of tissue-engineered bladder grafts by precisely controlling the spatial location of seed cells and materials to construct complex three-dimensional tissue structures. This study intends to use 3D bio-printing technology to reproduce the physiological structure of the bladder wall by layer-by-layer printing. Polycaprolactone was printed inside tissue-engineered bladder patches, and inter-communicating tubing was reserved in-house by computer-aided modeling to provide both good mechanical properties and vascular beds. The extracellular matrix was obtained from different levels of the bladder and microencapsulated vascular endothelial growth factor was added to prepare bio-ink for seed cell survival and neovascularization. Incubation through omentum, 3D-printed tissue engineered bladder patches was vascularized and further ripened. Finally, we retrieved the tissue-filled bladder patch with vascular pedicle to finish the cystectasy of experimental animals and verified the feasibility of bladder repair and reconstruction. This study aims to solve the problem of vascularization of tissue-engineered bladder grafts with the help of 3D bio-printing technology to realize the organic integration of three different pro-angiogenic mechanisms of "proangiogenic factor - vascular bed - in-vivo incubation".

组织工程膀胱移植物的血管化问题，是阻碍该技术临床应用转化的主要技术壁垒。3D生物打印技术通过精确控制种子细胞与材料的空间定位构建复杂的立体组织结构，有望解决组织工程膀胱移植物的血管化问题。本研究拟利用3D生物打印技术，通过逐层打印的方式再现膀胱壁的生理结构。将聚己内酯打印到组织工程膀胱补片内部，并通过计算机辅助建模技术在其内部预留互相交通的管道，使移植物兼备良好的机械性能和血管床。从膀胱不同结构层次获取细胞外基质，加入包栽血管内皮生长因子的微囊，制备可供种子细胞生存及诱导新生血管形成的生物墨水。通过大网膜包裹孵育，使3D打印的组织工程膀胱补片血管化并进一步成熟。最终，取回带血管蒂的组织工程膀胱补片行实验动物膀胱扩大术，验证其膀胱修复与重建的可行性。该研究借助3D生物打印技术，实现“促血管形成因子-血管床-体内孵育”三种不同的促血管化机制的有机整合，有望解决组织工程膀胱移植物的血管化问题。

膀胱恶性肿瘤和膀胱外伤等原因常导致膀胱缺损，膀胱缺损后的膀胱修补和替代治疗一直是临床亟待解决的科学难题。传统的肠道替代修补法具有较多并发症，而组织工程技术为膀胱修复重建提供了新的方向。本项目研究内容包括原代脂肪干细胞的分离、培养、鉴定和荧光标记；建立模拟生理过程的灌注膀胱脱细胞基质制备体系，并制备膀胱脱细胞基质水凝胶；利用甲基丙烯酰酐化明胶等材料制备3D生物打印用生物墨水及3D生物打印组织工程膀胱补片；丝素蛋白微球释放生长因子促进膀胱血管化；膀胱脱细胞基质凝胶和双层蚕丝支架构建组织工程膀胱，大网膜包裹孵育后行体内实验。首先，本项目分离培养了脂肪干细胞，并利用荧光染料进行标记，观察脂肪干细胞在支架材料中的生长、分布情况。其次，自行设计并搭建了一套膀胱灌注脱细胞系统，并筛选出一套快速高效的脱细胞方案，可快速实现全膀胱脱细胞基质的制备，促进全膀胱脱细胞基质的研究和应用。同时，利用甲基丙烯酰酐化明胶、甲壳素纳米晶体及碳化钛，加入膀胱脱细胞基质后制备了复合水凝胶，可作为3D生物打印生物墨水。此外，利用泌尿系统增强CT数据建立了全膀胱3D数据模型，分别使用甲基丙烯酰酐化明胶复合水凝胶、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和壳聚糖作为生物墨水，进行3D生物打印膀胱补片，建立了片状组织工程膀胱的3D生物打印体系，并积累了丰富的3D生物打印经验。另外，制备了包裹促血管生长因子（血管内皮生长因子和血小板源性生长因子）的丝蛋白微球，并对丝素蛋白微球中生长因子的加载效率和释放效率进行了检测。最后，利用丝素蛋白和膀胱脱细胞基质成功构建了组织工程膀胱补片，并进行了动物体内实验，从形态学、组织学和功能学三方面对组织工程膀胱补片的体内修复效果进行了详细评价，结果证实大网膜包裹孵育可以促进组织工程膀胱补片的血管化，制备的组织工程膀胱补片可促进缺损膀胱形态学、组织学和功能学的恢复。