小麦DOF转录因子调控谷蛋白合成与面筋品质形成的分子机制

In this study,various wheat genetic resources are used as materials, including a set of complete Triple HMW-GS deletion lines, glutenin near-isogenic lines, chromosome substitution lines and glutenin over-expression lines. Brachypodium distachyon accessions are used as control, in which HMW-GS and gliadin genes are silent. DNA binding with one finger (DOF) protein genes specifically expressed in seeds are cloned and characterized by allelic-specific PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE), and their molecular structures, functional domains and phylogenetic evolutionary relationships are investigated; In combination with the results of gluten and bread-making quality testing, phosphoproteome approaches and real-time quantitative reverse transcriptional PCR (qRT-PCR), the phosphorylation modification features of DOF proteins, dynamic transcriptional expression patterns during grain development and their relations with protein body development and gluten quality comformation are studied; The specific binding sites of DOF proteins to the promoters of glutenin genes as well as their regulations to glutenin protein synthesis are determined by yeast one hybrid (Y1H）and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The interacts of DOF proteins with storage protein activator (SPA) and other transcript factors, and their effects on glutenin synthesis and gluten quality conformation are explored by yeast two hybrid (Y2H) and Pull-down. The results obtained in this project will provide important theoretical basis for wheat quality improvement.

利用本课题组创制和引进的小麦贮藏蛋白亚基缺失突变系、近等基因系、染色体代换系和谷蛋白超表达系等一系列特殊遗传材料，以高分子量谷蛋白亚基和醇溶蛋白基因沉默的二穗短柄草作对照，克隆鉴定小麦种子特异表达的DNA结合锌指蛋白(DOF)基因，分析其分子结构特征、功能结构域及其系统进化关系；结合面筋和面包品质测定、磷酸化蛋白质组和qRT-PCR分析，研究籽粒不同发育时期DOF蛋白的磷酸化修饰特征、不同DOF 基因的动态表达模式及其与蛋白体发育和面筋品质形成的关系；利用酵母单杂交（Y1H）和凝胶阻滞电泳（EMSA）技术确定DOF蛋白与谷蛋白基因启动子的特异结合位点及其对谷蛋白合成的调控；通过酵母双杂交（Y2H）和Pull-down方法研究DOF蛋白与SPA等其他转录因子的相互作用及其对谷蛋白合成与面筋品质形成的影响，为小麦品质改良提供理论依据。

利用小麦最新基因组数据库鉴定到96个TaDof转录因子基因，贝叶斯法构建的系统进化树将TaDof转录因子基因家族成员分为5个亚家族，相同的亚家族间具有相似的外显子-内含子结构特征，多数小麦Dof基因仅含有1个或没有内含子。TaDof转录因子基因家族成员均含有保守的Dof结构域，同一个Dof转录因子亚家族成员中 Motif 的数量、类型以及空间排列较为相似，不同亚家族中Motif 分布明显不同，表明在进化过程中Dof转录因子为了更好地适应环境而发生了歧化。功能歧化分析发现II型功能歧化位点明显多于I型功能歧化位点，说明氨基酸的理化性质改变对TaDof转录因子基因亚家族之间的分化起关键作用。TaDof转录因子基因家族在进化过程中受到不同程度的正选择压力，筛选出4个极显著和 1 个显著发生正选择的氨基酸位点。共进化分析发现9组共进化氨基酸位点，这些位点可能有利于维持Dof蛋白的空间结构。转录表达分析显示小麦TaDof基因在根、茎、叶、穗和籽粒中均有表达，但具有明显的器官与籽粒发育阶段表达偏好，有的TaDof基因与籽粒贮藏蛋白表达模式一致，对贮藏蛋白合成具有重要调控作用。qRT-PCR分析揭示TaDof2、TaDof3 和 TaDof6基因在干旱条件下显著上调，对贮藏蛋白合成与面包品质形成具有重要促进作用。对拟南芥和小麦的遗传转化发现，TaDof2和TaDof6可能参与植物对干旱胁迫的响应，TaDof6基因可增强对低氮的耐受性。小麦中过表达TaDof6基因影响贮藏蛋白相关基因的表达，说明TaDof6转录因子可参与调控贮藏蛋白的合成。另外，首次分离克隆了面包小麦1By18基因，开发并验证了两个基于SNP变异的AS-PCR标记；克隆了Glu-B3h基因并开发了基于SNP变异的特异分子标记，可用于小麦品质改良中的标记辅助选择；研究了PDI3-1, PDI5-1, PDI6-1，PDI7-2和PDI8-1等二硫键异构酶基因表达对面包品质具有重要作用。项目研究期间在Mol. Breed.、Sci. Rep.、Front Plant Biol.、PLoS One、J. Cereal Sci.、J. Sci. Food Agric.等国际SCI期刊发表论文17篇，研究结果对深入了解植物Dof等转录因子基因家族的进化、表达与功能提供了新的证据，同时也丰富了小麦品质改良的基因资源和实用分子标