丹参酮IIA对胆汁淤积性肝纤维化小鼠门脉成纤维细胞的影响及机制研究

Biliary fibrosis is distinct from non-biliary fibrosis in fibrosis originating in the peri-ductular region and with the pathological signature of disregulated bile ductular proliferation. Previous studies indicated that portal fibroblasts were the "first responders" and played a crucial role in biliary fibrosis, but very little is known about the effect of drugs on portal fibroblasts. Chinese herb medicine Salvia has been widely used in the treatment of hepatic fibrosis. It was shown that tanshinone IIA, an effective component of Salvia, effectively inhibited benign stricture of bile duct fibroblasts proliferation and collagen secretion. Therefore, we hypothesized that tashinone IIA could inhibit portal fibroblasts activation/differenciation in biliary fibrosis. We will first prove anti-fibrogenic effect of thashinone IIA in BDL (bile duct ligation)-induced fibrosis in mice, then, we will use collagen-GFP BDL mice, isolate hepatic non-parenchymal cells and sort activated portal fibroblasts by flow cytometry, and explore the issue of effect of tanshinone IIA on portal fibroblasts activation, proliferation and its mechanisms in vivo and in vitro. This study will provide a new way and laboratory evidence for exploring anti-fibrogenic mechanisms of traditional Chinese medicine.

胆汁淤积性肝纤维化具有独特的病理学特点，如纤维化起源于胆管周围区域、伴大量不规则小胆管增生等。研究显示，门脉成纤维细胞是胆汁淤积性肝纤维化形成中的"第一反应细胞"，在胆汁淤积性纤维化形成中发挥重要作用，但药物对门脉成纤维细胞的影响目前研究甚少。中药丹参在抗肝纤维化治疗中广泛应用。研究发现，丹参的有效成分丹参酮IIA能抑制胆道良性狭窄胆管成纤维细胞增殖及胶原分泌，在此基础上拟探索丹参酮IIA 对胆汁淤积性肝纤维化小鼠门脉成纤维细胞的影响及其机制。采用胆总管结扎小鼠肝纤维化模型，首先在体外证实丹参酮IIA抑制胆汁淤积性肝纤维化形成，然后采用collagen-GFP小鼠造模，分离肝间质细胞，经流式细胞仪分选获取活化门脉成纤维细胞，分别在体内体外两个水平，研究丹参酮IIA对门脉成纤维细胞活化、增殖的影响及其与TGF-β/Smad信号通路的关系,为探索中药单体抗肝纤维化治疗靶点提供新线索和实验依据。

胆汁淤积性肝纤维化具有独特的临床和病理学特点，如纤维化起源于胆管周围区域、伴大量不规则小胆管增生等。既往研究显示，门脉成纤维细胞（portal fibroblast, PF）是胆汁淤积性肝纤维化形成中的“第一反应细胞”，在胆汁淤积性肝纤维化形成中发挥重要作用。但由于与肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）相比，PF分离困难，目前药物对PF的影响研究甚少。中药丹参在抗肝纤维化治疗中广泛应用。研究发现，丹参的有效成分丹参酮IIA能抑制胆道良性狭窄胆管成纤维细胞增殖及胶原分泌，在此基础上本研究拟探索丹参酮IIA对胆汁淤积性肝纤维化小鼠PF的影响及其机制。首先，成功构建胆总管结扎（bile duct ligation, BDL）致胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型（C57BL/6），经反复比较研究确定丹参酮IIA的最佳给药浓度为5mg/mL，最佳给药剂量为50ug/g。体外研究通过肝脏组织病理学、免疫组化染色、血清酶学指标、肝组织促纤维化因子、炎症因子mRNA水平检测等方法，证实丹参酮IIA可抑制胆汁淤积性肝纤维化小鼠的纤维化和炎症反应。继之，采用collagen-GFP小鼠进行胆汁淤积性肝纤维化造模，分离肝间质细胞，经流式细胞仪分选获取活化的门脉成纤维细胞，比较BDL术后不同时间PF来源肌成纤维细胞在胶原形成细胞中的比例。研究显示BDL术后5天PF在肌成纤维细胞中的比例为70%左右，其后有所下降，术后10天时为50%-60%。与BDL对照组比较，BDL+丹参酮IIA组小鼠胶原形成细胞中PF所占比例并无显著差异，PF细胞及其培养上清中TGF-β/Smad信号通路mRNA表达亦无显著性差异。体外培养未发现丹参酮IIA对PF增殖产生显著影响。研究结果提示，丹参酮IIA 可能并非通过直接影响门脉成纤维细胞的活化和增殖发挥抗纤维化作用，而可能通过其他途径，如抑制肝脏星状细胞活化增殖或抑制炎症反应等途径，也可能通过增加局部血流、改善肝细胞血供等途径减轻肝脏炎症反应，其作用机制有待进一步深入研究。