金黄色葡萄球菌CcpA蛋白对磷霉素耐药调控机制研究

CcpA is the global regulator of carbon metabolism in S. aureus, which takes a similar position as cAMP receptor protein (CRP) in gram-negative bacteria. Studies have shown， In Escherichia coli, CRP and UhpABC binds to upstream sequence of uhpT, initiates transcription, and results in strain’s fosfomycin resistance. Our previous study shows that deletion of uhpT confers fosfomycin resistance in S. aureus. In S. aureus, HptRSA complex regulates uhpT transcription(like UhpABC in E. coli). However, whether CcpA regulates uhpT transcription in S. aureus, through similar mechanisms as CRP in E.coli, is still unclear. In this study, we are going to: 1）knock-out and complement the suspected genes, to clarify the effect of CcpA on fosfomycin resistance and uhpT transcription，and multiple reaction monitoring is used for UhpT quantification; 2)isothermal titration calorimetry and elecrophoretic mobility shift assay are used to investigate the molecular mechanism; screen CcpA mutation in clinical and laboratory induced fosfmycin-resistant S. aureus strains to veryfy the protein’s function to fosfomycin reisistance. This study would help to understand the mechanism of S.aureus fosfomycin resistance in a view of transcriptional regulation, and may provide theoretical support for drug development for the future.

CcpA是金葡菌糖代谢的全局调节子，与革兰阴性菌中cAMP受体蛋白（CRP）功能相似。研究表明大肠埃希菌UhpABC和CRP可结合uhpT上游序列，启动后者转录，导致细菌对磷霉素耐药性下降。前期研究发现，敲除金葡菌uhpT可导致细菌对磷霉素耐药。文献报道金葡菌HptRSA复合体可调控uhpT转录（与大肠埃希菌的UhpABC相似）；而CcpA是否调控uhpT基因转录（与CRP类似），从而造成细菌磷霉素耐药，尚不明确。本研究拟：1）在标准株中敲除和回补CcpA相关蛋白，质谱多反应监测技术测定UhpT蛋白量，以明确CcpA通过调控uhpT转录，影响细菌磷霉素耐药性；2）等温滴定量热、电泳迁移率变动分析等方法探究CcpA蛋白对uhpT转录水平调控的机制；3）筛查诱导耐药株和临床株，验证CcpA影响金葡菌磷霉素耐药性。本研究旨在从转录水平进一步探究金葡菌磷霉素耐药机制，可为研发新的抗菌药物提供依据。

金葡菌磷霉素耐药水平逐年上升，而其耐药机制尚不明确。CcpA是金葡菌糖代谢的全局调节子，与革兰阴性菌中cAMP受体蛋白（CRP）功能相似，接受外界环境的影响，调控一系列耐药、毒力、生物膜相关表型。研究表明：大肠埃希菌UhpABC和CRP可结合uhpT上游序列，启动后者转录，导致细菌对磷霉素耐药性下降。前期研究发现，敲除金葡菌uhpT可导致细菌对磷霉素耐药。文献报道金葡菌HptRSA复合体可调控uhpT转录（与大肠埃希菌的UhpABC相似）；而CcpA是否调控uhpT基因转录（与CRP类似），从而造成细菌磷霉素耐药，尚不明确。本研究拟探究金葡菌磷霉素耐药机制，为研发新抗菌药物提供依据。由于Reed等报道了CcpA对hptRS系统的调控作用（PLos One, 2018），故本研究着重于阐明hptRS系统对金葡菌临床分离株磷霉素耐药特性的影响。首先，课题组收集2004-2014年复旦大学附属华山医院住院患者无菌体液分离得到的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）共50株,采用琼脂稀释法测定磷霉素最低抑菌浓度;聚合酶链反应(PCR)及测序分析hptR、hptS、hpt4及uhpT、glpT、fosB基因的变异情况，发现这些MRSA中广泛存在hptR、hptS、hptA基因变异,而一些突变类型仅在磷霉素耐药株中出现，其中hptA截短突变仅存在于fosB（-），uhpT和glpT基因均为野生型的磷霉素耐药MRSA菌株中，推断其可能与金葡菌磷霉素耐药表型密切相关。因此，我们采用RT-PCR分析了hptA基因失活（截短突变）的临床分离磷霉素耐药CcpA菌株的相关基因表达水平，发现正如我们预期，hptA失活会导致转运蛋白uhpT表达水平上升5-6倍，而菌株磷霉素耐药水平显著上升。综上，CcpA系统可受细菌糖代谢影响，通过hptRSA-uhpT系统，影响细菌磷霉素耐药表型。