基于非培养技术分析鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构改变及其与EB病毒潜伏感染的可能关联

The temperature, moisture and complex anatomy structure of the human nasopharyngeal cavity provide a perfect enviroment for the growth, propagation and colonization of the commensal nasopharyngeal flora. In our previous study, we demonstrated that the human nasopharynx has an unique microbiome structure with some un-specified bacterial species. We thus hypothesis that the dysbiosis of nasopharyngel microbiome might play a role in the carcinogenesis of NPC by interacting with Epstein-Barr Virus(EBV) latent infection. To validate this hypothesis, we will compare the nasopharyngeal microbial colonization patterns of NPC patients with healthy donors. Considering large amount of bacteria could not be analyzed by traditional methodology which are based on culture. In this study, we will use deep pyrosequencing of bacterial 16S rRNA gene to compare NPC tumor microbiomes to that of healthy donors. The study will not only provide a first high-resolution map of nasopharyngeal dysbiosis that are associated with EBV latent infection and nasopharyngeal carcinogenesis, but also will address the relevant key bacterial spieces. These findings will possibly discover novel etiological factors of NPC. By targeting those factors, NPC will become a preventable malignancy.

鼻咽腔的温度湿度和复杂的解剖结构，为微生物的生长、繁殖和定居提供了适宜的环境。我们的前期研究证实鼻咽部栖居着种类繁多的细菌群落，其中包括一些未分类菌种，共同构成其独特的细菌群落结构，依此推测鼻咽部共生菌群结构改变可能与鼻咽癌（NPC）细胞EB 病毒的潜伏感染以及NPC的发生有关。传统基于培养的研究方法无法检测样本中占大多数的未可培养和非可培养微生物，因此无法开展肿瘤相关微生物组研究。本研究拟采用宏基因组学研究方法，利用非培养的微生物鉴定技术，通过16S rRNA基因高通量测序对细菌群落结构进行高通量分析，阐明NPC患者鼻咽部细菌群落结构的变化，以期明确鼻咽部微生境改变与EB病毒潜伏感染、NPC发生的可能关联；探索与EB病毒潜伏感染和NPC发生相关的细菌种群；阐明鼻咽部细菌群落结构改变在NPC发病及演进中的可能角色。若能在此方面有所发现，将可开展针对性干预，将使NPC成为一个可预防的恶性肿瘤

在本研究中，我们首先建立了无污染的鼻咽拭子的采集方法，以避免采样过程中来自鼻腔细菌的污染；再优化了鼻咽拭子的DNA抽提方法，充分裂解细菌壁以最准确地反映鼻咽部微生物的多样性；我们还优化了来自鼻咽拭子的微量DNA样本的16s rRNA混样建库的方法，以确保建库过程的真实性。由此建立了一套研究鼻咽部菌群的采样和基于16s rRNA基因高通量测序建库的标准流程。用这一技术流程，我们比较了鼻咽癌患者与健康对照组之间鼻咽部菌群结构的差异。我们发现鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构是以生物多样性降低，并且在菌属水平克雷伯氏菌/棒状杆菌的比例显著增高为特点。我们纳入了鼻咽癌高危人群队列，通过检测高危人群的鼻咽部菌群结构并分析其和鼻咽部EBV载量、和生活习惯的关系，发现高危人群鼻咽部EBV载量与血清EBV抗体水平和发病风险均相关，但与吸烟等生活习惯无关联。对高危人群鼻咽部EBV载量进行分组和分层抽样，并通过16s rRNA基因高通量测序，我们发现，鼻咽癌高危人群鼻咽部EBV载量与菌群物种多样性呈负相关，且EBV零拷贝组以棒状杆菌为主，EBV高拷贝组以克雷伯杆菌居多。这提示鼻咽部菌群结构的改变在鼻咽癌临床发病前就存在，并可能参与EBV的潜伏感染调控及癌发生的过程。通过细胞实验，我们验证了鼻咽部共生细菌可影响鼻咽癌细胞中EBV的潜伏感染状态。因此，鼻咽部菌群结构改变可能作为微环境因素，参与鼻咽癌的发生，提示这可能是鼻咽癌发病的一个新的机制。