调控表观遗传相关酶的关键因子筛选及其对细胞核重编程的作用研究

Both the SCNT (Somatic Cell Nuclear Transfer) and iPS (induced pluripotency stem) techniques could revert highly differentiated somatic cells to pluripotency or totipotency.Reprogramming factors and epigenetic modifications play important roles in this process, but the mechanisms by which they regulate reprogramming are yet to be clarified. Based on previous studies, we propose that reprogramming factors control the nuclear reprogramming process through modulating the epigenetic pattern and spatial and temporal profile of gene expression by regulating transcription of epigenetic modifying enzymes. Using luciferase reporter system, Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation(ChIP), we will examine the effect of several reprogramming factors on the promoter activities of epigenetic modifying enzyme genes to find out the factors that have direct control over their transcription. To further address possible roles the key factors play in the reprogramming process, gene overexpression, RNA interference and rescue in mouse cloned embryos will be performed, followed by examination of the epigenetic modification patterns and expression profiles of key development related genes by immunofluorescence microscopy and real-time PCR. Furthermore, artificial intervention will be employed to improve the efficiency of somatic cell reprogramming. This study will provide new insight into the molecular mechanism of nuclear reprogramming and basis for promote the clinical application of reprogramming technology.

细胞核移植和iPS技术可以使高度分化的体细胞重编程回复到多能或全能状态，重编程因子和表观遗传修饰在这一过程中起着十分重要的作用，但它们如何调控重编程尚不清楚。我们推测重编程因子是通过调节表观遗传修饰相关酶基因的转录来改变表观遗传模式，进而改变关键基因的特定时空表达，以实现对细胞核重编程的调控。鉴于此，本项目拟利用荧光素酶报告基因系统、凝胶阻滞迁移和免疫共沉淀的方法，研究几个重要的重编程因子对编码表观遗传相关酶基因转录调控的分子机制，筛选出直接调控酶基因转录的关键因子。通过在小鼠核移植克隆胚中进行过表达、RNA干扰和挽救实验，结合间接免疫荧光和实时定量PCR的方法检测表观遗传模式和重要发育相关基因表达谱，分析重编程因子在细胞重编程中的作用。在此基础上，试图通过人工干预的方法提高体细胞重编程效率。本研究将为阐明细胞重编程的分子机制提供新的思路，也将为推动重编程技术在临床治疗中的应用提供依据。

体细胞重编程是当今研究的热点领域，其具体的分子机制至今仍旧不是十分清楚，但至少可以肯定的是重编程因子和表观遗传修饰在重编程过程中起到重要的作用，然而遗憾的是关于这二者相关性的研究不是很多。本项目在前期研究基础上，致力于揭示重编程因子和表观遗传修饰之间偶联的分子机制。通过生物信息学分析，我们发现部分转录因子在表观遗传修饰相关酶基因启动子上存在结合位点，随后我们又通过启动子分析技术研究转录因子是否存在调控表观遗传修饰相关酶基因转录的可能性，并试图通过一系列离体和在体实验加以证实。结果表明Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc和Klf4等重要的重编程因子通过直接与表观遗传修饰相关酶基因启动子发生物理性相互作用以影响基因启动子活性进而调控其转录，最终实现重编程因子与表观遗传修饰协同调节。体细胞重编程效率低下是体细胞重编程广泛应用和开展的主要瓶颈。本项目在筛选到某些重要因子之后，试图尝试利用显微注射和培养系统的优化提高重编程效率，然而效果并不是十分理想，其主要原因在于任何一个生物学过程都是大量基因协同表达的结果，而非单一基因所能实现的。为此，我们对以卵丘细胞和MEF细胞为供体构建的不同时期的植入前克隆胚胎进行单细胞RNA测序，以体内胚为对照（遗传背景相同），着重分析体细胞重编程过程中mRNA和非编码RNA表达模式，发现，植入前胚胎发育早期克隆胚（合子期至4-细胞期）在RNA加工、修饰和翻译起始等过程存在严重缺陷，造成克隆胚早期发育过程中出现表观缺陷，无法有效开启基因组使染色质重构。此外，我们还发现大量各期特异性且与表观遗传修饰相关的新mRNA和lncRNA转录本，进一步暗示表观重编程不彻底是导致基因再激活和重编程效率低的主要原因。本研究结果将加深对重编程理解，较为全面的揭示非编码RNA在不同类型供体细胞核重编程过程中的作用和功能，也为核重编程技术在再生医学和农业等行业的推广和应用奠定基础。