PIAS-NY在精子发生中的作用机制

前期工作中我们克隆了PIASx基因一个新的剪接体，该基因仅表达于成人睾丸及胰腺中。应用酵母双杂交技术，我们发现了一个新的与其相互作用的DNA解旋酶RUVBL2。本课题试图在此基础上进一步探讨PIAS-NY在精子发生过程中的作用机制。首先运用荧光素酶实验明确PIAS-NY对STAT4及AR转录活性的调节，运用SUMO化法检测PIAS-NY是否具有SUMOE3连接酶活性。其次构建一系列PIAS-NY及RUVBL2截短片段及缺失突变体质粒，应用酵母双杂交及免疫共沉淀法确定两者相互作用的核心区域。利用荧光素酶实验检测PIAS-NY对RUVBL2转录活性的调节。应用SUMO实验检测PIAS-NY与RUVBL2 SUMO化之间的关系。构建PIAS-NY过表达及抑制表达的细胞系，观察其对RUVBL2表达的影响。通过这些研究有望阐明PIAS-NY基因在精子发生过程中的分子调控机制。

PIAS2是PIAS蛋白家族中特异性高表达于睾丸组织中的一个亚型，PIAS-NY是前期工作中发现的PIAS2的新成员之一，其在精子发生中的作用尚不清楚。为探讨PIAS-NY在精子发生中的作用机制，我们用酵母双杂交的方法筛选到PIAS-NY的一个相互作用蛋白-RUVBL2。本项目研究了精子发生中PIAS-NY与RUVBL2的相互作用机制。首先分析了PIAS-NY及其相互作用蛋白RUVBL2、RUVBL1在睾丸组织中的表达情况：应用分子克隆的方法，构建了原核表达质粒，表达和纯化了PIAS-NY的原核蛋白，并应用该蛋白免疫小鼠，制备了PIAS-NY的多克隆抗体。应用免疫组织化学法分析了PIAS-NY、RUVBL2及RUVBL1在不同发育期睾丸组织中的表达情况，结果显示，PIAS-NY表达于各级生精细胞中，特别是在初级精母细胞中表达水平最高。同时，RUVBL2和RUVBL1也主要表达于初级精母细胞中，提示PIAS-NY，RUVBL2及RUVBL1三种蛋白在初级精母细胞中发挥重要的调节作用。第二，应用酵母双杂交及免疫共沉淀技术明确了PIAS-NY与RUVBL2之间的相互作用：通过直接酵母双杂交实验，证实了在酵母细胞中PIAS-NY可以与RUVBL2相互作用；通过免疫共沉淀技术，证实在哺乳动物细胞中外源性和内源性的PIAS-NY和RUVBL2均能相互作用，PIAS-NY也能与RUVBL1相互作用；应用亚细胞定位的方法证实PIAS-NY和RUVBL2能共同定位于哺乳动物细胞核内从而发生相互作用。第三，通过酵母双杂交技术确定了RUVBL2与PIAS-NY相互作用的最小区域。结果显示PIAS-NY 的C末端RLD结构域为其RUVBL2相互作用的最小区域。而RUVBL2蛋白与PIAS-NY作用的最小区域为第二个Domain I。第四，通过SUMO化修饰实验来研究PIAS-NY对RUVBL2的调控作用机制，结果提示PIAS-NY可能通过非SUMO化修饰的方式与RUVBL2相互作用。第五，通过构建PIAS-NY过表达小鼠精母细胞系，探讨了PIAS-NY与RUVBL2的相互作用机制。通过Western Blot定量分析发现，过表达PIAS-NY蛋白能增加RUVBL2和RUVBL1的蛋白表达量。上述研究结果为揭示PIAS-NY在精子发生中的作用提供了重要的线索。