激活PERK信号通路上调GSK-3β磷酸化在百草枯致肺纤维化中的机制研究

Epithelial-mesenchymal transition plays an important role in Paraquat(PQ)-induced pulmonary fibrosis. Recent studies suggest that GSK-3β is involved in modulating EMT signaling pathway. Inactivation of GSK-3β (GSK-3β phosphorylation) could activate EMT-related gene expression, and promote pulmonary fibrosis. Recent finding by our group have demonstrated that the inhibition of PERK signaling pathway could alleviate GSK-3β phosphorylation. We inferred that the activation of PERK signaling pathway could increase eIF-2α phosphorylation, which prompt Akt activation, resulting in GSK-3β phosphorylation thus promoting EMT in pulmonary fibrosis. We will use overexpression and inhibition method to confirm the regulation of GSK-3β phosphorylation by PERK signaling pathway and its role in PQ-induced EMT. Through chromatin immunoprecipitation (CHIP), Western Blot and reverse blocking technology, we will clarify the molecular mechanism of PERK signaling pathway regulation GSK-3β phosphorylation. The goal is to provide therapeutic target and insight of preventing PQ-induce pulmonary fibrosis.

上皮-间质转化（EMT）是百草枯中毒致肺纤维化的重要原因。文献报道，GSK-3β是EMT信号通路的关键环节。当GSK-3β磷酸化失活后，将激活EMT相关基因的表达，促进肺纤维化的发生。课题组前期研究提示抑制PERK信号通路可以阻止GSK-3β磷酸化，减轻百草枯中毒引起肺纤维化。因此我们分析PERK信号通路激活后产生大量磷酸化的eIF-2α，促使Akt活化，进而通过上调GSK-3β磷酸化诱导肺上皮细胞发生EMT导致肺纤维化。本项目拟在整体和细胞水平上，通过诱导和抑制PERK信号通路，证实PERK信号通路对GSK-3β磷酸化水平的影响，研究其在百草枯诱导肺上皮细胞EMT中的作用；通过免疫共沉淀、Western blot及反向阻断技术等，阐明PERK信号通路调控GSK-3β磷酸化的分子机制，为百草枯中毒寻找新的治疗靶点提供理论和实验依据。

上皮-间质转化(EMT)是百草枯(PQ)中毒致肺纤维化的重要原因。文献报道，GSK-3β是EMT信号通路的关键环节。当GSK-3β磷酸化失活后，将激活EMT相关基因的表达，促进肺纤维化的发生。本项目主要探讨PERK信号通路是否通过上调GSK-3β磷酸化诱导肺泡上皮细胞发生EMT，从而在PQ导致肺纤维化中发挥作用，并探讨其信号调控通路，为PQ中毒致肺纤维化寻找新的治疗靶点提供理论和实验依据。本项目通过体内及体外研究证实了PQ中毒后内质网应激PERK信号通路相关蛋白（PERK及p-eIF2α）表达增加，体外应用siRNA抑制PERK表达后，肺泡上皮细胞EMT变化程度减轻，磷酸化的GSK-3β增加，说明PERK信号通路可能通过调控GSK-3β磷酸化参与PQ诱导的EMT。同时发现，在建立百草枯中毒体外模型基础上(A549和RLE-6TN细胞)，采用PI3K的抑制剂LY294002处理后，p-PI3K,p-Akt及p-GSK-3β表达明显减少；上皮标志物E-cadherin表达增加；间质标志物α-SMA表达减少，提示我们PI3K/Akt/GSK-3β参与PQ诱导EMT过程。我们进一步研究发现，采用PERK的小干扰RNA抑制内质网应激的PERK信号通路，与PQ染毒组相比， p-PI3K,p-Akt及p-GSK-3β表达减少，且差异具有统计学意义。因此我们认为在百草枯中毒中，PERK信号通路可能通过PI3K/Akt/GSK-3β参与诱导EMT相关基因的表达，促进肺纤维化的发生。最后，课题组在前期工作证实上皮-间质转化在百草枯致肺纤维化中发挥重要的基础上，进一步探讨在其他原因导致肺纤维化中，上皮-间质转化的作用，并探寻其机制，揭示了在博来霉素导致的肺纤维化中，肺泡上皮细胞NLRP3炎症小体通过TGF-β1通路调控上皮-间质转化。为临床上救治多种病因导致的肺纤维化提供一定得理论指导意义。