强侵袭性杜莫氏军团菌致病机制的相关研究

Legionnaires' disease is an acute respiratory infectious disease with high mortality. Legionella is the pathogen of Legionnaires' disease. There are more than 50 species of Legionella genus. Legionella dumoffii is one of major species cause human diseases, which causes pneumonia more serious than that caused by Legionella pneumophila. Previous studies have revealed that L. dumoffii strain TEX-KL have a higher invasiveness to epithelial cells than L. pneumophila. In this study, we want to reveal the pathogenicity of L. dumoffii TEX-KL through three aspects of study. Firstly, we attempt to find the specific genes or gene chain relating to invasiveness of L. dumoffii TEX-KL by constructing transposon randomly inserted gene variant colonies library and screening the invasiveness weakened strain by infecting the epithelial cells. Secondly, we attempt to speculate the physiological processes which L. dumoffii TEX-KL invasion host cells by inhibiting experiments of phagocytosis, endocytosis and microtubule polymerization. Thirdly, we want to use whole-genome sequencing and comparative genomics methods to reveal the difference of structural proteins of Dot/Icm IV secretion system between L. dumoffii and L. pneumophila and identify the whole-genome sequences and biological functions of plasmids in L. dumoffii TEX-KL' s genome. It is expected that the pathogenicity of L. dumoffii could be comprehensive revealed, and then control Legionella growth and reproduction in the host cells, weaken the pathogenicity of Legionella and reduce the occurrence and spread of Legionnaires' disease.

军团菌病是一种急性呼吸道传染病，致死率高，其病原体为军团菌。目前已知的军团菌属有50余个种。杜莫氏军团菌是能引起人类患病的主要的军团菌种之一。与嗜肺军团菌引起的肺炎相比，杜莫氏军团菌引起的军团菌肺炎发病快，症状严重，病死率高。研究发现，杜莫氏军团菌较嗜肺军团菌对上皮细胞具有更高的侵袭力。我们采用转座子随机插入建立变异基因菌落库，进而通过感染于上皮细胞进行侵袭力减弱菌株筛查的方法，研究杜莫氏军团菌的特异性侵袭基因和基因链。通过抑制宿主吞噬，内吞及微小管聚合的方法，推测杜莫氏军团菌入侵宿主的生理过程，阐明杜莫氏军团菌在上皮细胞中强侵袭性机制。通过全基因组测序和比较基因组学方法揭示杜莫氏军团菌与嗜肺军团菌四型分泌系统结构蛋白的差异以及质粒全基因序列和生物学功能的鉴定。从而全面诠释杜莫氏军团菌的致病机制，对控制军团菌在环境中的生长繁殖，减弱军团菌致病性，降低军团菌病的发生和传播具有重要意义。

军团菌病是一种急性呼吸道传染病，其病原体为军团菌。目前已知的军团菌属有50余个种。杜莫氏军团菌L. dumoffii是能引起人类患病的主要的军团菌种之一，与嗜肺军团菌L. pneumophila引起的肺炎相比，L. dumoffii引起的军团菌肺炎发病快，症状严重，病死率高。但L. dumoffii致病机制未知，与宿主之间相互作用的机制也不明确，这正是目前国内外对军团菌研究的盲点之一。本研究中采用转座子随机插入的方法建立由801株转座子插入基因变异菌株组成的菌株库，将纯化得到的转座子变异菌株逐一感染于肺泡上皮细胞A549和人宫颈癌HeLa细胞系中，用军团菌吉曼尼兹染色和菌落计数的方法，以野生L. dumoffii为阳性对照，不具侵袭性的L. pneumophila为阴性对照，找到1株侵袭性减弱的基因突变L. dumoffii菌株，命名为KL15。通过侵袭基因的分子生物学分析，初步确定对杜莫氏军团菌在上皮细胞中的侵袭起主要作用的基因为traC基因。通过RT-PCR方法验证 traC-traATi构成操纵子结构。我们推断traC-traATi操纵子对杜莫氏军团菌的侵袭性起主要作用。将 L. dumoffii 进行了全基因组的测序工作，并且对其 Dot/Icm 四型分泌系统的结构蛋白进行了解析，通过比较基因组学的分析，比较了其与嗜肺军团菌 Dot/Icm 四型分泌系统结构蛋白的区别。从分析结果中可以看出， L. dumoffii 的四型分泌系统结构蛋白比较集中连续，没有辅助蛋白的插入，而L. pneumophila的四型分泌系统中插入了其他与毒力无关基因。这些插入蛋白的功能与四型分泌系统稳定性的关联，还有待于我们下一步的研究分析。细菌侵袭进入宿主细胞主要是三种作用机制，分别为微丝介导型吞噬、微小管介导型聚合和受体介导型内吞。我们通过运用这三种机制的抑制剂分别作用于上皮细胞，再将野生L. dumoffii 和侵袭基因缺失菌株感染于上皮细胞，通过共聚焦显微镜找到它们之间的侵袭差异。嗜肺军团菌在侵袭进入上皮细胞的时候，主要依靠微丝介导型吞噬，而L. dumoffii TEX-KL的侵袭机制为受体介导型内吞。通过本课题的研究成果，诠释了杜莫氏军团菌的致病机制。对控制军团菌在宿主中的生长繁殖，减弱军团菌致病性，降低军团菌病的发生和传播具有重要意义。