PDE4亚型参与肺纤维化病理过程的分子机制研究

Pulmonary fibrosis (PF) is the final outcome of many lung diseases, but its pathogenesis is unclear. Our previous study found that phosphodiesterase 4 (PDE4) subtype expression changed significantly in the development process of bleomycin-induced pulmonary fibrosis, combined with the NCBI GEO database information, we speculate PDE4 isoforms genes.is an IPF-related gene. But limited subtype selectivity of PDE4 inhibitor, the fine regulation of PDE4 isoforms in lung fibrosis is unclear. Our previous study found that only on PDE4B isoform knockout mice, mortality rates of bleomycin-induced pulmonary fibrosis is decreased, suggesting the fine division of of PDE4 isoforms presence in pulmonary fibrosis. Using PDE4 subtype knockout mice, alveolar type II epithelial cells, fibroblasts, and circulating fibrocytes as the research object, this project will study the regulation of PDE4 isoforms on fibroblast proliferation, activation, conversion and other actions, the regulation of PDE4 isoforms on the process of epithelial-mesenchymal transition, as well as the recruitment and differentiation of circulating fibrocyte, thus preliminary analyze the molecular mechanism of PDE4 on the process of pulmonary fibrosis, while providing new targets for clinical treatment of pulmonary fibrosis.

肺纤维化是许多肺部疾病的最终转归，发病机制尚不清楚。我们的前期研究发现磷酸二酯酶4(PDE4)亚型在博莱霉素诱导的肺纤维化发生发展过程中表达有明显改变，结合NCBI的GEO数据库资料，我们推测PDE4是IPF相关基因。但因现有PDE4抑制剂亚型选择性都不强，对于亚型在肺纤维化过程中的精细调控作用尚不清楚。我们的进一步研究发现只有PDE4B亚型敲除小鼠对博莱霉素诱导肺纤维化的死亡率有下降，提示PDE4亚型在肺纤维化过程中存在精细分工。本课题将从动物模型、细胞培养两个层面，以PDE4亚型基因敲除小鼠、肺泡II型上皮细胞、成纤维细胞及循环纤维细胞等为研究对象，深入研究PDE4亚型对成纤维细胞的增殖、活化、转化等行为，上皮细胞的转化，循环成纤维细胞的招募及分化等的影响及相关分子机制，初步解析PDE4亚型参与调控肺纤维化发生发展过程中的分子机制，同时为肺纤维化临床治疗提供新靶点。

在体外实验中，我们采用TGF-β1来处理不同的成纤维细胞建立成纤维细胞-肌成纤维细胞转化的体外细胞模型及上皮细胞间质转化的体外细胞模型,检测由TGF-β1诱导HLF-1 和MRC5细胞的纤维化因子（例如α-SMA，I型胶原，纤维连接蛋白）的表达。及相关的EMT指标。结果发现PDE亚型在这两种细胞模型上均有差异表达，通过表型鉴定，我们明确了PDE10A抑制剂罂粟碱对成纤维细胞肌化有作用，而PDE4抑制剂对EMT起作用。我们明确了罂粟碱可抑制TGF-β1诱导HLF-1 和MRC5细胞的纤维化因子（例如α-SMA，I型胶原，纤维连接蛋白）的表达。罂粟碱抗纤维化的机涉及TGF/-catenin、TGF-smad2通路。在体内实验中，通过博来霉素气道滴注C57BL/6N小鼠来诱导肺纤维化模型。我们采用腹腔注射方式给予PDE10A抑制剂罂粟碱分别从第7天到21天。通过masson三色染色法来检测胶原纤维积聚以确认罂粟碱是否能减少肺纤维化的形成。另外通过组织免疫荧光法检测α-SMA的表达含量以及位置来阐述罂粟碱的靶标细胞以及相应的影响，检测beta-catenin通路蛋白来确认罂粟碱的具体作用途径。PDE4基因敲除小鼠的体内实验证明PDE4B的敲除能明显降低博来霉素诱导肺纤维化的死亡率。明显优于PDE4抑制剂rolipram 的效果。PDE4B敲除小鼠对于博来霉素诱导的肺纤维化的保护作用可能与TGF-1/Smad通路以及TGF-1/p-ERK通路有一定的关系。