构建永生化牙囊细胞系应用于牙周组织再生的相关实验研究

Periodontal disease may cause the tissue decay and tooth missing, and the tissue engineering technology is the ideal way for periodontal tissue regeneration.Based on the source of seed cells, the cell sheet scaffold and regeneration of key issues, this project suggests that dental follicle cells are the most potential for periodontal tissue engineering seed cells to construct immortalized mouse dental follicle cells, analyze the biological characteristics of cells, and explore potential avenues for new organization of the periodontal tissue engineering by cell sheet composite PLGA-collagen scaffold. Exogenous hTERT gene will be transfected to the rat dental follicle cells in vitro to establish the immortalized mouse dental follicle cells and observe its biological characteristics change. Culture cells in vitro for multi-layer structure layer of cells, induce cells by the methods such as the gene transfection technique, implant on rat's subcutaneous by using green fluorescent protein markers before compound to "PLGA-collagen scaffolding", and evaluate the periodontal tissue function activity. Results will help to provide enough the periodontal seed cell, evaluate the efficiency of the cell sheet scaffold and PLGA-collagen scaffold. This will enhance and construct the specific shape by using the the periodontal organization, provide a new way for the periodontal organization reparative regeneration.

牙周疾病可引起组织缺损并导致牙齿缺失，组织工程技术系牙周组织完全性再生的理想途径。项目针对种子细胞来源、细胞片层支架复合以及诱导再生等关键性问题，提出牙囊细胞是最具潜质的牙周组织工程种子细胞，构建永生化鼠牙囊细胞系并分析其生物学性状，探讨其经细胞片层复合"PLGA-胶原支架"诱导获取组织工程化的牙周新生组织的潜在途径。先期将外源性hTERT基因转染至体外培养的鼠牙囊细胞中，建立永生化鼠牙囊细胞系并观察其生物学特性改变；细胞片层技术体外培养永生化牙囊细胞获取多层细胞片层结构，经基因转染、生长因子、细胞外基质等方法对其进行诱导，绿色荧光蛋白标记后再复合到"PLGA-胶原支架"上植入裸鼠皮下，评测组织工程化的新生牙周组织功能活性。这将为牙周再生提供充足的种子细胞来源和评测细胞片层、PLGA-胶原支架效用，提高牙周种子细胞利用效率并构建特定形态的牙周组织，为牙周组织修复性再生提供新思路。

牙周病是一种累及牙齿软、硬支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨)的慢性、感染性疾病。牙周再生修复，尤其是完整结构和功能的牙周膜再生最为困难，涉及到牙周组织工程中的多方面应用。牙囊细胞是存在牙囊中的细胞，其已被证明在体内体外均具有多向分化潜能。但牙囊细胞存在组织来源有限，组织中细胞含量少，细胞在体外增殖困难等特点。因此如何有效的获得足够量的细胞、并保持细胞生物学特性的一致性和稳定性，是组织工程中急待解决的问题。PiggyBac转座系统与传统基因转染方法相比，具有操作简便、效率高、整合位点易确定、转座基因可长期稳定表达等优点。因此，本项目旨在采用piggyBac可逆性永生化系统建立人牙囊细胞系，并对获得的永生化及去永生化牙囊细胞的增殖活性、多向分化潜能进行全面系统的研究。本项目结合已有的牙周GTR技术、细胞膜片技术和牙周膜特殊的解剖结构和微环境特点，提出“引导牙周膜组织再生技术”实验构想：以人牙囊细胞+多孔脱钙牙本质基质膜片复合体，构建组织工程牙周膜样结构。人牙囊细胞（hDFCs）是牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞的前体细胞，牙囊细胞膜片能提供足量、稳定的种子细胞，同时以其自身分泌的细胞外基质维持其自身活性。自体多孔脱钙牙本质基质（DDM）膜片具有柔软、富有弹性、良好的机械强度和细胞亲和性、骨诱导特性、无免疫排斥等特点，能够维持牙槽骨植入区牙囊细胞膜片的粘附、增殖、分化生长的微环境，防止骨植入材料对细胞膜片的挤压，引导牙周膜细胞和纤维的再生。