ROS和ATM蛋白在亚精胺致线粒体自噬过程中的调控机理研究

Mitophagy, a selective process of removing superfluous or damaged mitochondria through autophagy, is critical for maintaining proper cellular functions. Spermidine is a ubiquitous polyamine that is able to induce autophagy and anti-aging in various model organisms and cultured cells, thus making it a prosperous and well-focused field of study. The applicant demenstrated that spermidine could induce mitophagy, but the underlying molecular mechnisms are unknown. To address this issue, human fibroblast cell lines GM00637 (normal) and GM05849 (ATM deficient) are selected, and ROS scanvengers NAC and Tempo are used to explore the roles and mechanisms of ROS and ATM activation in modulating exogenous spermidine-induced mitophagy. First, flow cytometry will be performed to measure the intracellular ROS content. Transmission electron microscope and fluorescence microscope are employed to determine if mitochondria are damaged. Meanwhile, the expression levels of PINK1 and Parkin, two proteins identifying impaired mitochondria and selectively targeting them for mitophagy, and LC3 and p62, two indictors of autophagy will be detected by immunoblot analysis to see if spermidine could induce mitophagy. Furthermore, ATM activation will be checked using immunofluorescence. Colocalization and co-immunoprecipitation will be carried out to see if ROS and ATM could regulate PINK1/Parkin signaling. With the specialized cell models, we could perfectly address the issues that if spemidine could induce PINK1/Parkin-mediated mitophagy and if this effect is ROS and ATM dependent. These findings will deepen our insights into the molecular mechanisms of mitophagy and its regulatory roles in maintaining cellular functions.

线粒体自噬是调节细胞内线粒体数量，维持细胞正常功能的一种生理过程，其与ROS和ATM蛋白密切相关。申请人所在课题组前期研究证实，维持机体正常生物学功能所必需的亚精胺能诱导线粒体自噬，但其如何受ROS和ATM蛋白调控尚不清楚。本项目以人成纤维细胞系GM00637（ATM+/+）和GM05849（ATM ?/?）为研究材料，亚精胺处理或氧自由基清除剂+亚精胺处理后，采用流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光和免疫共沉淀等技术检测线粒体损伤和线粒体自噬的发生，细胞内ROS含量和ATM蛋白激活情况，ATM蛋白与线粒体自噬特异性蛋白PINK1、Parkin的细胞内共定位情况及其相互作用关系，从而探究ROS和ATM蛋白如何调控亚精胺诱导的线粒体自噬。本研究结果可为深入认识线粒体自噬的调控机制及其在维持细胞正常生理功能中的作用提供参考。

亚精胺是一种细胞内源性多胺类物质，参与细胞增殖、凋亡和细胞周期调控等众多生物学过程。其含量随着细胞衰老或者机体年龄的增加逐渐减少。然而，外源亚精胺可以通过诱导细胞自噬，延缓细胞或者机体衰老。自噬（Autophagy）是真核细胞受到外源或者自身代谢产生的刺激胁迫时，依赖溶酶体，将胞质内大分子物质或受损细胞器降解为小分子物质，然后被细胞重新合成大分子或ATP而循环利用，以维持细胞内稳态的过程。特异性清除受损线粒体的自噬过程称为线粒体自噬（Mitophagy）。线粒体作为细胞的能量工厂，易受氧化胁迫攻击，及时清除受损线粒体对于维持细胞代谢的稳态十分重要，而亚精胺是否可以诱导特异的线粒体自噬性仍然未知。.ATM蛋白是共济失调性毛细血管扩张综合症突变体正常基因编码的产物，主要作为启动核DNA双链损伤应答途径的关键调控因子，在细胞核内发挥作用以维持核基因组稳定性，也有一部分ATM在细胞质内各个细胞器中参与调控代谢的稳态，定位于线粒体上的ATM蛋白参与线粒体稳态的调控，并且在ATM功能缺失时，线粒体自噬受阻，但其参与线粒体自噬调控的具体分子机制仍知之甚少。.为了探讨这些问题，本项目以ATM野生型的GM00637(ATM+/+)和ATM缺失的GM05849（(ATM-/-)）细胞为研究材料，来探讨亚精胺是否能诱导线粒体特异性自噬的发生，并阐明ATM蛋白在亚精胺诱导的线粒体自噬过程中的作用。此外，结合ATM蛋白特异性抑制剂KU55933预处理GM00637细胞后，进一步确定ATM蛋白在线粒体自噬发生过程中的作用，并初步探讨其发挥作用的分子机制。.研究结果显示，亚精胺可引起GM00637细胞线粒体去极化，诱导线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的形成，PINK1在线粒体上的蓄积和Parkin由胞质向线粒体的易位，最终导致线粒体质量（Mitochondrial mass）降低，即发生线粒体自噬现象。然而，在GM05849或KU55933预处理的GM00637细胞中， PINK1的蓄积和Parkin的易位受到抑制，Parkin与LC3或PINK1的共定位也受到显著影响。这些结果显示，ATM蛋白激活了亚精胺诱导的线粒体自噬的级联反应，在线粒体自噬过程中发挥重要的调节作用，通过调节PINK1的蓄积和Parkin的易位来控制线粒体自噬的正常进行。本研究使得亚精胺调控细胞自噬的研究得到进一步深入，