家蚕核型多角体病毒呈递外源基因到脊椎动物组织的机理研究

Autogragha californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) is an effective tool in delivering target genes into vertebrate cells. However, it can be inactivated by complement in vivo and no significant improvement was achieved after experimenting with various methods. Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus (BmNPV) showed a phenomenon of anti-inactivation to the complement of mice, chicken and human. It is available of delivery and expression of luciferase and EGFP reporter genes in main vertebrate organs (brain, liver, kidney, spleen, lung, pancreas and bursal of Fabricius, etc.) in vivo. According to the results above, the purpose of this research is to optimize the expression cassette of BmNPV derived vertebrate genes delivery system. Trans-acting factor, enhancer, DNA replicon, etc. will be used in BmNPV multigene expression system to improve the expression level and increase the expression time of target genes. The research of gene exchange between hybrid baculovirus and corresponding virus will be the reference to reveal the mechanism for greater stability against complement inactivation of BmNPV. The membrane penetrating peptides, pseudotype BmNPV and surface display of complement inhibitor, etc. will be used to improve the efficiency of foreign gene delivery and expression. The experiment of gene delivery of IBDV gene vaccine, which using IBDV antigen genes, will provide a foundation for the study of novel animal DNA delivery system in vivo.

杆状病毒科苜蓿夜蛾核型多角体病毒可将外源基因高效呈递到脊椎动物细胞进行表达，在体内实验时发现补体对其有很强的灭活作用，尝试用各种方法进行改良后，并未取得很好效果。发现家蚕BmNPV对小鼠、鸡、人的补体有较好的抗灭活现象，能有效将荧光素酶和EGFP基因呈递到脊椎动物的各个主要器官（脑、肝、肾、脾、肺、胰腺、法氏囊等）并表达。基于此发现，进行BmNPV脊椎动物外源基因呈递系统的表达盒优化，应用BmNPV多位点表达系统进行反式因子增强启动子活性、增强子、DNA复制子等提高外源基因在器官内表达的研究，基于杂交杆状病毒和相应的病毒基因组间交换解析BmNPV具有较强抗补体灭活作用机理；应用穿膜肽、假型化BmNPV、补体抑制剂表面展示等增加BmNPV在活体内呈递和表达外源DNA的效率；以鸡法氏囊病毒的抗原基因等为对象进行鸡法氏囊病毒基因疫苗的实验，为研究新的动物活体DNA呈递系统提供基础。

杆状病毒苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）用以向脊椎动物细胞中呈递外源基因，成为一种常用表达工具，研究工作主要在细胞水平上进行的，但是AcNPV很容易被哺乳动物宿主的补体灭活，从而失去呈递外源基因的功能，所以很难在个体或组织水平上进行呈递，从而限制了其作为基因呈递载体的功能。发现家蚕杆状病毒BmNPV对动物（人）的补体具有很好的抗补体灭活作用，分析了其抗补体灭活的原因；在快速构建BmNPV为骨架的重组病毒载体的基础上进一步研究了该病毒载体向脊椎动物细胞和个体中呈递外源基因表达。我们选用EGFP和Luciferase两个报告基因分别进行研究，探明了呈递的外源基因在动物体内各组织器官表达规律；对CMV、CAG、PEC和HLP肝特异启动子等四种启动子，改善表达效率的rAAV包装系统的反向末端重复序列ITR在脊椎动物组织中驱动外源基因表达的启动子和表达盒元件进行了比较和优化；阐明了小鼠和鸡这两种实验动物作为呈递基因的BmNPV呈递载体向脊椎动物组织中的最佳呈递外源基因效率的使用方法；并对有FVIII遗传缺陷的小鼠进行了人FVIII因子的呈递实验和效率比较分析，发现全长基因的FVIII治疗效果更好，解决了重组BmNPV杆状病毒进行FVIII基因治疗所涉及的病毒定量、使用方式、启动子选择等问题；证明经家蚕杆状病毒多次呈递外源基因后并不影响呈递效率，而且高度同源的外源基因在异种生物体内多次表达几乎不产生抗体，有望成为新的基因治疗载体的能力。.在此基础上还对上述研究结果进一步延伸到动物禽流感广谱中和抗体的呈递表达、鸡法氏囊病毒、狂犬病毒、新冠病毒的口服疫苗研发，表明经口呈递在体内能有效表达相应抗原或抗体，结合铁蛋白自组装纳米颗粒技术，有望拓展成为动物口服疫苗尤其是流浪动物用口服疫苗的研发技术平台。本研究共发表论文13篇，其中SCI收录6篇；授权和申请发明专利各2项。