NMDA受体GluN2B亚基酪氨酸磷酸化调控新机制及其在脑缺血损伤中的作用

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor is a glutamate gated ion channel formed by multiple subunits, and different NMDA receptor subtypes determined by GluN2 subunits have the differential functions in all kinds of physiological and pathological conditions. Herein, it is significant to uncover the differential regulation mechanism of NMDA receptor subunit and its role in specific condition. Accumulating evidence suggested GluN2B contained NMDA receptor at extra-synaptic sites is mainly involved in brain ischemia injury, and tyrosine phosphorylation of GluN2B at 1472 site is important for this process, however, the mechanism is largely unknown. One of the applicant recent studies uncovered a novel mechanism which 1070 site regulated the phosphorylation of 1472 tyrosine site, and we have constructed the GluN2B-Y1070F knockin mice. By combining pharmacology, biochemistry, electrophysiology and behavior test techniques, we aim to determine whether 1070 site regulated phosphorylation of 1472 site is the common pathway of multiple signaling pathways induced phosphorylation of 1472 site, elaborate the role and underly the mechanism of 1070 tyrosine site in ischemia injury in vivo, and try to provide a novel therapeutic target for stroke in future.

NMDA受体是多亚基谷氨酸门控离子通道，因其GluN2亚基的不同而形成功能迥异的受体亚型，并在许多生理和病理过程中导致不同的后果。因而，揭示NMDA受体亚基选择性调控机制及其在特定生理和病理过程的作用具有重要意义。以往研究提示脑缺血损伤与突触外NMDA受体及GluN2B亚基更为关联，也与GluN2B的1472酪氨酸磷酸化上调有关，然而，相关机制有待进一步阐明。申请人最近发现GluN2B胞内C端的1070和1472酪氨酸磷酸化位点存在协同调控的新机制，并成功制作了GluN2B-Y1070F突变小鼠。本项目拟应用GluN2B-Y1070F突变小鼠，并组合使用生化、药理学、电生理及行为学等方法，从in vivo水平深入阐明GluN2B亚基Y1070协同调控Y1472磷酸化机制，验证其是否为多信号途径调控Y1472磷酸化的共同通路，并探索其在脑缺血损伤中的作用、机制及选择性干预。

NMDA受体介导了多种生理病理功能，研究表明NMDA受体不同亚基的磷酸化修饰能够调控受体膜运输和受体门控等过程。近年来研究发现GluN2亚基存在多个酪氨酸磷酸化位点，我们先前研究报道了GluN2B的酪氨酸1070位点磷酸化能够通过协调调控酪氨酸1472位点磷酸化进而改变受体膜表达，然而该位点在整体水平对NMDA受体介导的功能尚不清楚。本研究首先制备了GluN2B亚基的NMDAR受体C端酪氨酸1070位点突变的小鼠（下文统称为1070KI小鼠），行为学检测发现该突变小鼠没有影响海马相关行为，而是出现抗抑郁样表型，在慢性束缚造模后观察到1070KI小鼠抗抑郁表型稳定，表现为强迫游泳实验中不动时间明显变短，糖水偏好实验中的快感缺失，提示GluN2B酪氨酸1070位点的磷酸化参与并调控了到抑郁症相关的过程。生化结果显示在基础水平上该突变小鼠仅在前额叶皮层显著降低了1472位点磷酸化水平。CRS造模后WT小鼠mPFC脑区1070位点的磷酸化平显著上升，但是1472位点的磷酸化水平却没有任何变化，这也说明酪氨酸磷酸化在基础水平和在应激之后的调控是截然不同的。进一步研究发现1070位点突变后该脑区5-6层的锥体神经元突触上受体功能并不受影响而是突触外GluN2B 型NMDAR受体功能被下调，有功能的突触数目增加且兴奋性突触传递增强，提示该突变小鼠很可能通过下调突触外NMDA受体介导抗抑郁样行为。进而，研究发现1070位点突变小鼠增加了mTORC1活性综合以上数据，我们揭示了一种mPFC脑区NMDAR受体酪氨酸磷酸化调控介导抑郁症的新机制，为阐明NMDA受体介导MDD疾病提供了新的思路。