双分子探针探索TF表达沉默阻断胰岛移植中IBMIR非免疫损伤的实验研究

Islet transplantation is an effective treatment for type I diabetics by reconstituting endogenous insulin secreting tissue. Instant blood mediated inflammatory reaction (IBMIR) is a first key factor affecting the efficacy of islet transplantation. Tissue factor (TF) has been proved as the trigger of IBMIR with thrombosis as its featured characteristic. We have previously shown that IBMIR can be blocked in an in vitro IBMIR model by s TF antisense RNA-mediated silencing of TF expression in islets. In order to determine whether IBMIR can be also blocked in vivo by TF silencing and investigate whether the development of IBMIR during and after islet transplantation can be monitored, we aim to develop a non-invasive and real-time monitoring technology to evaluate in vivo inhibition of IBMIR by TF silencing using a TF silencing and tracing molecular probe, shRNA-GFP to target TF along with a thrombus targeted molecular fluorescent probe to detect IBMIR. This study will provide a new technology to monitor IBMIR in vivo, thereby leading to the development of a clinically applicable treatment to protect islet graft against IBMIR.

胰岛移植是建立内源性胰岛素分泌系统治疗I型糖尿病最有效的方法。立即经血液介导的炎症反应（IBMIR）是影响胰岛移植疗效的第一个关键因素。组织因子TF是激发IBMIR的始动因子，血栓形成是IBMIR的重要特征。前期研究证实，特异性靶向TF的反义RNA在体外IBMIR模型中能初步阻断IBMIR发生。但是在复杂的体内环境中TF沉默能否抑制IBMIR？如何活体实时监测移植过程中IBMIR的发生？这是我们需要进一步解决的问题。本项目拟利用靶向TF的shRNA-GFP作为胰岛细胞TF沉默及示踪的分子探针，结合特异性血栓靶向的小分子荧光探针，利用双分子探针分子影像技术实时无创地监测移植过程中TF沉默胰岛细胞是否阻断IBMIR发生;通过长期监测糖尿病鼠的血糖变化及病理检测移植物存活情况，评估IBMIR的发生程度,判断分子探针的灵敏度。该项目的研究将为我们在胰岛移植中进行IBMIR监测及移植物保护提供新方法

胰岛移植是建立内源性胰岛素分泌系统治疗I型糖尿病最有效的方法。立即经血液介导的炎症反应（IBMIR）是影响胰岛移植疗效的第一个关键因素。组织因子TF是激发IBMIR的始动因子，血栓形成是IBMIR的重要特征。前期研究证实，特异性靶向TF的反义RNA在体外模型中能初步阻断IBMIR发生。但在复杂的体内环境中TF沉默能否抑制IBMIR？如何进行活体实时监测？是我们需要进一步解决的问题。在本项目研究过程中我们首先使用FITC标记反义RNA，转染猪胰岛细胞后在荧光显微镜下检测，结果显示约有40%胰岛细胞有荧光显示，Real-time PCR和Western Blotting结果显示反义RNA能够在mRNA和蛋白水平抑制TF的表达。通过在荧光显微镜下手工挑选TF沉默后的胰岛细胞团，检测发现TF沉默胰岛的活力及体外葡萄糖刺激应答能力都未受影响，免疫组化检测胰岛细胞的内分泌结构，发现TF沉默胰岛没有影响其内分泌结构。在肝内活体成像实验中，我们在制备好糖尿病模型后，选择了合适的近红外染料进行不同处理的胰岛标记，通过荧光强度判断移植物损伤程度，进而判断IBMIR发生。移植后成像观察，对照组由于IBMIR的剧烈发生，导致移植物损伤，造成染料释放，代谢进入膀胱，膀胱处荧光强度较强，而我们的TF沉默胰岛细胞实验组在肝脏处一直显示较强的荧光，显示大量完整的胰岛细胞仍然在肝脏处停留，IBMIR的发生程度明显减轻。在不同实验时间点分组进行血液学检测：检测各时点下腔静脉血小板数量，TAT含量，判断凝血系统的激活程度，发现对照组小鼠胰岛移植后15分钟血清TAT水平明显升高，几乎是实验组的3倍；检测血糖和猪c-peptide发现对照组移植后30min-60min，小鼠血糖急速显著下降，60min在外周血中可检测到c-peptide可判断胰岛细胞被破坏，实验组移植后60min并无血糖的明显下降，也不能检测到c-peptide；对移植肝脏进行病理学检测，实验组相对于对照组小鼠肝窦内胰岛细胞周围血栓包裹较少，且大部分胰岛细胞团完整，证明抑制TF的表达可以抑制IBMIR的发生。我们的研究从影像学，病理学和分子生物学多方面证实了TF沉默能够抑制体内IBMIR的发生。该项目的研究将为IBMIR的发生与TF的表达相关提供影像学证据，为我们在胰岛移植中进行移植物保护提供新方法，为实时监测IBMIR的体内发生提供新思路