自杀基因Tet调控杀瘤系统在乳腺癌基因治疗中诱导DNA 损伤的分子机制研究

Tet基因表达调控系统能在真核细胞中特异的定量控制外源基因包括自杀基因的表达。在前期研究中，我们成功利用Tet调控系统对乳腺癌自杀基因治疗中的胸苷激酶tk1实施了精确的调控，除此之外该自杀基因调控治疗系统能将乳腺癌细胞大量阻滞于S期，诱导DNA合成与DNA损伤相关基因大量表达，并促进癌细胞大量死亡。我们推测，该调控治疗系统增强自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤不但是通过激活胸苷激酶使底物磷酸化抑制 DNA聚合酶，而且有可能参与DNA 损伤过程，抑制细胞周期调控，进而达到增强杀伤肿瘤细胞的效果。为证实这一假说，我们拟用已建立的实验模型，采用分子生物学、细胞生物学等方法，从 DNA 损伤与修复及 DNA 合成的角度探讨 Tet调控自杀基因治疗系统对乳腺癌细胞增敏杀伤的机理。本课题将从新的角度阐明 Tet调控自杀基因治疗系统杀伤肿瘤细胞的分子机制，为增强乳腺癌自杀基因治疗效果提供新的思路。

目的：探讨Tet-On调控HSVtk/GCV基因系统治疗乳腺癌促乳腺癌细胞DNA损伤、凋亡及抑制细胞迁移的影响及分子机制。方法：采用转染、病毒感染等方法，将HSVtk基因导入乳腺癌细胞中， MTT及集落形成实验检测细胞增殖；流式细胞术、DAPI染色检测细胞凋亡。运用QRT-PCR及Western blotting检测DNA损伤修复、凋亡、迁移等相关分子在mRNA、蛋白水平的表达变化；免疫荧光检测BRCA1、γ-H2AX等分子在细胞中的定位；划痕实验观察调控后对乳腺癌细胞迁移的影响。结果：该系统干预MCF-7后，MTT和集落形成实验显示MCF-7细胞的体外增殖明显受抑； Western blotting检测到HSVtk+GCV+Dox组PARP1蛋白发生剪切，流式细胞术检测到凋亡细胞。划痕实验显示诱导干预组中MCF-7细胞的迁移受抑，而SKBR-3细胞中迁移变化不明显。Western blotting显示，在MCF-7细胞中，干预组中相关蛋白PARP、TK1、Ral A、ATM、γ-H2AX、BRCA1、PNKP、R2、TK1、CHK2、P21 、caspase-3和p53的表达均明显上调；迁移相关蛋白E-cadherin、MTDH和calpain的表达明显上调。在SKBR-3细胞中，干预后PNK、ATM、γ-H2AX、BRCA1、p53的表达上调明显，PARP、Rb、Ral A和TK1的表达降低。DDP作用癌细胞6 h后即有γ-H2AX出现，随作用时间延长有上调趋势。RT-PCR验证atm、chk2、p53、p21、p27在DDP作用于MCF-7细胞株后表达上调。DDP干预后磷酸化的ATM、Chk2蛋白表达水平显著上调。结论：Tet-On调控HSVtk/GCV自杀基因系统致乳腺癌细胞损伤的分子机制是通过DNA损伤相关蛋白ATM、BRCA1、p53途径抑制细胞周期；通过PARP、PNK、γ-H2AX、TK1、Ras蛋白诱导DNA损伤并阻止DNA碱基修复最终导致细胞死亡并诱导癌细胞发生凋亡。由p53、Ral A 作用的乳腺癌细胞在上述过程中会同时激活PARP、calpain等，进一步抑制细胞钙黏蛋白或MTDH等表达，从而抑制癌细胞迁移能力。而p53失活的乳腺癌细胞则不能通过此途径来抑制癌细胞的迁移。